食品中的花青素及其與金屬離子的相互作用

朱曉路，陳文博，王玉玲，賈國(guó)超

鄭州工程技術(shù)學(xué)院（鄭州 450044）

富含酚類抗氧化劑的植物和食品，特別是水果、蔬菜和谷物被廣泛研究，因?yàn)樗鼈冊(cè)诮档腿祟惵院徒到庑约膊★L(fēng)險(xiǎn)方面起著關(guān)鍵作用。花青素，作為天然食品著色劑已使用多年，廣泛應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、功能性食品配方成分及藥物成分等方面[1]。花青素是一類黃酮類化合物，由水溶性色素組成，可使花卉、水果、谷物和蔬菜等呈現(xiàn)紅色、藍(lán)色和紫色，如葡萄、藍(lán)莓、黑加侖、覆盆子、山楂、桑葚、黑豆、黑米、紫薯和紫甘藍(lán)等物質(zhì)中都含有豐富的花青素[2]。花青素的結(jié)構(gòu)特征性很強(qiáng)，以1個(gè)苯環(huán)、1個(gè)含氧三碳雜環(huán)和1個(gè)苯環(huán)結(jié)合而成，是典型的C6—C3—C6骨架結(jié)構(gòu)，其母核結(jié)構(gòu)是2-苯基苯并吡喃陽離子，穩(wěn)定性較差，在C3，C5和C7位上極易發(fā)生羥基取代反應(yīng)，故在自然界中幾乎不存在游離的花青素，通常情況下與糖結(jié)合形成花色苷。花青素種類豐富，對(duì)人體健康非常有益，與金屬離子作用機(jī)制多樣化，如在調(diào)節(jié)鐵代謝方面，抑制鐵調(diào)素的表達(dá)。由于花青素在食品工業(yè)中的重要性，了解其提取純化方法，以及與金屬離子的相互作用具有一定意義。

1 食品中主要花青素組成及其功能

1.1 食品原料中花青素的組成

花青素廣泛存在于開花植物（被子植物）的花、果實(shí)、莖、葉、根器官的細(xì)胞液中，分布在27個(gè)科、72個(gè)屬的植物中，其在植物中的含量和種類隨著食品類別、品種、季節(jié)、氣候等的不同有很大的差別，且通常與糖結(jié)合形成花色苷，結(jié)合的糖主要有葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、己糖和半乳糖等。花色苷中的糖苷基和羥基還可以與羧酸及其衍生物發(fā)生酰基化反應(yīng)，如草酸、乙酸、丙二酸、蘋果酸、P-對(duì)香豆酸、咖啡酸等，酰基化的花色苷穩(wěn)定性相對(duì)較高[3]。花色基元的結(jié)構(gòu)及其共軛糖苷和酰基的結(jié)構(gòu)、位置和數(shù)量決定花青素種類的多樣性，已發(fā)現(xiàn)的花青素及其衍生物有600多種。

Willemse等[1]通過MSE、MS/MS分析多種食品原料中的花青素組成，如表1，藍(lán)莓和黑豆中花青素主要以花青素-3-O-單糖苷形式存在，且花青素種類繁多，包括錦葵色素、芍藥色素、牽牛花色素、矢車菊素和飛燕草素等；而紅葡萄皮中則含有多種酰基化衍生物，這些化合物分別由相應(yīng)的花青素與乙醛和丙酮酸等反應(yīng)形成，這可能與葡萄發(fā)酵和葡萄酒陳釀?dòng)嘘P(guān)。衍生化的花青素極性降低，因此在Hilic中的保留率低于天然花青素。紫甘藍(lán)中發(fā)現(xiàn)10余種花青素成分，值得注意的是，紫甘藍(lán)中花青素種類只有矢車菊素衍生物，區(qū)別只在于糖基的數(shù)量和酰化基團(tuán)的類型和數(shù)量，形成了多種不同的矢車菊素-3-二/三葡萄糖苷-5-葡萄糖苷酰基化模式。紅心蘿卜中的花青素主要是天竺葵色素-3-二葡萄糖苷-5-葡萄糖苷的酰化衍生物，主要取代基是-對(duì)香豆酰基、-阿魏酰基和-丙二酰基。婁秋艷[4]利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，分析黑米中的花青素組成，主要包括矢車菊素-3, 5-二葡萄糖苷、矢車菊素-飛燕草素-己糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-蕓香糖苷，其中矢車菊素-3-葡萄糖苷為主要成分，含量約占81.99%。李甘[5]分析紫洋蔥的花青素組成，包括矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3, 5-O-二葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3, 5-O-二葡萄糖苷。不同的食品原料中花青素組成有很大差別，同一類的食品原料也因?yàn)槠贩N及生長(zhǎng)環(huán)境等條件的影響不盡相同。

表1 5種食品中花青素的組成

1.2 花青素的主要功能活性

花青素屬于生物類黃酮物質(zhì)，而黃酮物質(zhì)做主要的生理活性功能是自由基清除能力和抗氧化能力。花青素本身易氧化，然而容易被氧化的化合物通常是最好的抗氧化劑，這是因?yàn)槠淠軌蛱峁┳杂呻娮踊驓涔┓磻?yīng)自由基。據(jù)研究，食品原料的抗氧化活性與花青素的含量存在線性相關(guān)性且成正比，花青素和花青素糖苷的抗氧化活性高于維生素C和維生素E。王燕等[6]采用FRAP法、ABTS法和DPPH法測(cè)定紫鵑茶花青素的抗氧化能力，在研究濃度范圍內(nèi)，紫鵑茶花青素的總抗氧化能力、清除ABTS+自由基和DPPH自由基的能力均與其濃度呈正相關(guān)，且通過對(duì)比得出能力均強(qiáng)于VC。童丹等[7]采用DPPH自由基法測(cè)定定西地產(chǎn)“黑美人”馬鈴薯中花青素的抗氧化能力，花青素含量越高，DPPH自由基清除率越高，抗氧化活性越強(qiáng)。

花青素優(yōu)秀的抗氧化能力使其具有抗疲勞衰老、抗腫瘤、抑菌、調(diào)節(jié)脂肪代謝、糖類代謝和腸道菌群等多種功能，其抗氧化機(jī)制主要表現(xiàn)在：減少活性氧積累和清除自由基、減少DNA損傷、激活酶抗氧化系統(tǒng)以及與金屬離子發(fā)生作用等[8]。Chen等[9]從黑米中提取的花青素對(duì)癌細(xì)胞有抗轉(zhuǎn)移作用，具體表現(xiàn)為對(duì)AP-1的DNA結(jié)合活性和核轉(zhuǎn)位有抑制作用，在體內(nèi)對(duì)SKHep-1細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用。膽管癌與麝貓后睪吸蟲感染有關(guān)，矢車菊素和飛燕草素糖苷提取物與姜黃結(jié)合形成花青素復(fù)合物，針對(duì)感染麝貓后睪吸蟲的倉鼠進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，復(fù)合物增加自由基清除能力，降低炎癥，抑制氧化/硝化應(yīng)激反應(yīng)，減少肝損傷和導(dǎo)管周圍纖維化[10]。

2 食品中花青素的主要提取和純化方法

2.1 食品中花青素的主要提取方法

溶劑萃取法一直是最常用的一種提取方法，可以從水果、蔬菜等食品原料中提取多種化合物，包括黃酮類化合物。花青素是極性分子，因此提取花青素的溶劑通常包括甲醇、乙醇、醋酸酸化水、鹽酸介質(zhì)中的乙醇和丙酮水溶液[11]。這些方法意味著需要后續(xù)純化以去除同時(shí)被提取出的非酚類物質(zhì)（如糖、有機(jī)酸和蛋白質(zhì)等），如固相萃取法。溶劑的類型、濃度、體積、溫度、提取時(shí)間和提取方法等因素對(duì)提取率有顯著影響，這些因素的組合和最佳條件的確定非常重要[12]。

在酸化溶劑萃取中，應(yīng)特別注意避免使用強(qiáng)酸介質(zhì)，因?yàn)轷；ㄉ湛赡軙?huì)降解，如果是3-單苷花青素，糖苷鍵可能會(huì)被破壞[13]。為了提取酰基化花青素和3, 5-二甘醇，有必要使用弱酸介質(zhì)（甲酸或乙酸）避免其水解，當(dāng)使用弱酸介質(zhì)時(shí)，可能提取出更多不同的花青素[11]。最常用的萃取劑是酸化甲醇或乙醇，酸性甲醇提取最有效，提取能力要優(yōu)于酸性乙醇，然而，在食品工業(yè)中，乙醇和有機(jī)酸更可取，因?yàn)樗鼈儽燃状己望}酸的毒性相對(duì)小一些；且乙醇提取過程中可以同時(shí)除去果膠蛋白和淀粉等雜質(zhì)。王鳳娟[14]對(duì)比去離子水、0.1%鹽酸、甲醇、乙醇、酸性乙醇、酸性甲醇、丙酮對(duì)紅菊苣中花青素的提取率，結(jié)果表明，紅菊苣花青素提取的最佳溶劑是酸性甲醇，但是考慮到食品安全性問題，試驗(yàn)最終選擇了酸性乙醇作為后續(xù)提取溶劑。浸泡法也被廣泛應(yīng)用于花青素提取，尤其是葡萄酒行業(yè)，將新鮮葡萄進(jìn)行研磨，使葡萄汁與皮一起浸泡以提取色素[15]。

除了溶劑的選擇，一些輔助方法的使用可以提高花青素提取效率，如超聲波提取法、超臨界CO2提取法、酶法處理提取、微波輔助提取法及組合使用方法等。張?jiān)娗涞萚16]優(yōu)化酶-超聲波法提取桑葚中花青素的工藝參數(shù)，確定超聲波的最佳提取功率為180 W，纖維素酶的最佳添加量為8 mg/g。曾琳等[17]采用浸提法、超聲波輔助法及微波輔助法提取黑米中的花青素，微波輔助法提取花青素的穩(wěn)定性最強(qiáng)；而超聲波輔助法提取花青素的效率最高，但穩(wěn)定性最弱；浸提法提取的花青素穩(wěn)定性介于二者之間，但提取率最低。楊萍等[18]利用微波輔助和有機(jī)溶劑相結(jié)合提取黑枸杞中的花青素，確定最佳微波時(shí)間116 s、微波功率146 W。超聲波法經(jīng)常被用于提取芳香物質(zhì)、多糖、多酚等，在液體中，超聲波會(huì)閉合并激發(fā)出瞬間強(qiáng)壓力，產(chǎn)生強(qiáng)烈的擾動(dòng)效應(yīng)、空化效應(yīng)等多級(jí)效應(yīng)，增加溶劑的穿透力，使植物細(xì)胞受壓破裂，快速融出細(xì)胞中所要提取的目標(biāo)物，有效縮短提取時(shí)間。常規(guī)浸提法的提取效率相對(duì)較低，因其難易打破原料內(nèi)部結(jié)構(gòu)，僅可提取出淺表的目標(biāo)物，造成提取不徹底。微波輔助技術(shù)有操作簡(jiǎn)便，提取速度快，提取效率高和溶劑可循環(huán)利用，減少污染物排放量，改善生產(chǎn)環(huán)境等特點(diǎn)。

2.2 花青素提取物的主要純化方法

現(xiàn)有提取方法對(duì)花青素沒有選擇性，因?yàn)樗萌軇┰谔崛〕龌ㄇ嗨氐耐瑫r(shí)能夠提取大量其他的化合物，如糖、蛋白質(zhì)或有機(jī)酸。因此，有必要實(shí)施后續(xù)新的純化技術(shù)，以分離出要研究的目標(biāo)花青素。

從上述目的出發(fā)，各種各樣的技術(shù)被用于花青素的分離純化，從簡(jiǎn)單的固相萃取（SPE）和液液萃取（LLE）到復(fù)雜的色譜技術(shù)，如高速逆流色譜法（HSCCC）、中壓液相色譜（MPLC）、和高效液相色譜（HPLC）等。SPE通常在含大孔吸附樹脂、C18或交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）柱子中進(jìn)行，其中花青素通過其羥基與填料緊密結(jié)合，通過添加不同極性的溶劑來實(shí)現(xiàn)花青素與其他化合物的分離。大孔吸附樹脂是20世紀(jì)60年代以來發(fā)展起來的有機(jī)高聚物吸附劑，具有很好的吸附性能。由于吸附量大、成本低、效率高、可再生等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛應(yīng)用于不同類型植物中花青素的富集分離純化。AB-8型大孔吸附樹脂被多方認(rèn)證為常用最佳吸附樹脂之一，作為弱極性的樹脂，在吸附過程中，AB-8大孔吸附樹脂易和色素形成氫鍵，使它們之間的結(jié)合更加牢固[14,19-20]。HSCCC和MPLC用作純化方法，通過高效液相色譜法進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，LC-MS/MS進(jìn)行組分結(jié)構(gòu)鑒定，優(yōu)點(diǎn)是最大限度地減少分離純化時(shí)間和流動(dòng)相溶劑的使用量，效率相對(duì)較高，精確度高。高效液相色譜法檢測(cè)花青素最常用的檢測(cè)器是紫外-可見光檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)器。

各種純化技術(shù)既可以是獨(dú)立存在，同時(shí)又是相輔相成的，2種或多種技術(shù)相結(jié)合達(dá)到的效果通常是1+1＞2，可以分離得到更高純度的花青素單體。Zou等[21]運(yùn)用高速逆流色譜分離從草莓提取物中分離出3種花青素，經(jīng)鑒定為天竺葵素-3-蘆丁苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷和天竺葵素-3-葡萄糖苷，純度分別達(dá)到95.6%，96.2%和99.3%。Yao等[22]采用柱層析和高速逆流色譜相結(jié)合的方法，從桑樹果實(shí)中分離出高純度的花青素單體。使用Amberlite XAD-7HP柱子和80%乙醇（0.1% HCl）純化得到純度為68.6%的花色苷混合物，后采用正丁醇∶甲基叔丁基醚∶乙腈∶水∶三氟乙酸（30∶10∶10∶50∶0.05，V/V）雙相溶劑體系的高速逆流色譜法分離得到飛燕草素-3-O-蕓香苷、矢車菊素-3-O-蕓香苷和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷3種花青素單體，并通過核磁共振和液相質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行鑒定。郭丹妮等[23]將藍(lán)莓粗提取先經(jīng)過葡聚糖凝膠色譜初步分離，得到花青素粗提液，經(jīng)過高速逆流色譜分離得到純度分別為65.0%和90.0%的2種花青素。Zhang等[24]通過柱層析和半制備HPLC技術(shù)相結(jié)合，從紫色甘薯中分離出兩種高分子量酰化單體花色苷。

3 花青素提取物與金屬離子的相互作用研究

花的顏色的多樣性最初解釋是金屬離子和花色基元黃洋鹽之間形成螯合物的緣故。在金屬-花青素絡(luò)合物中，Mg2+與飛燕草苷型花青素絡(luò)合可以形成藍(lán)色；而對(duì)矢車菊素-花青素形成藍(lán)色起重要作用的是與Fe3+；繡球花的藍(lán)色涉及非黃酮類與Al3+的絡(luò)合；桔梗的藍(lán)色花瓣也可能是通過分子內(nèi)和分子間的堆積以及極少量的金屬離子的存在[25]。盡管早期人們對(duì)花青素-金屬絡(luò)合物在食品工業(yè)中的應(yīng)用研究較少，但是這個(gè)相互作用卻為保持顏色的穩(wěn)定性提供了積極的可行性方案，特別是當(dāng)所含的金屬對(duì)健康無害，甚至是飲食中必需礦物質(zhì)的一部分。不同的花青素在同一種金屬離子作用下反應(yīng)不盡相同；同一種花青素在不同金屬離子作用下反應(yīng)也不相同。金屬離子在水中會(huì)分解出酸，使溶液呈酸性，花青素在不同pH條件下呈現(xiàn)不同的顏色，因此金屬離子的加入可以改變花青素的顏色。一些金屬離子的加入，能夠有效提高花色苷的穩(wěn)定性；也有部分金屬離子可以和花青素發(fā)生螯合作用生成螯合物[26]。

一些關(guān)于植物顏色穩(wěn)定性的研究表明，藍(lán)色是由于花青素與一些金屬如鋁、鐵、銅和錫之間的絡(luò)合作用。花青素在B環(huán)上如果有臨位羥基（如Cy、Dp、Pt），可以和鐵、鈣、銅、鋁等金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)形成花青素-金屬絡(luò)合物。根據(jù)此特征，通過向花青素溶液中加入金屬離子，觀察其紫外吸收光譜的變化，可以判斷該類花青素B環(huán)是否有臨位羥基。金屬離子的濃度、作用對(duì)象和pH環(huán)境等的不同，其顏色的保護(hù)效果和穩(wěn)定性也不一樣[27]。篤斯越橘果實(shí)花青素提取物在pH 3.0條件下，對(duì)Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Al3+均表現(xiàn)了一定的穩(wěn)定性[28]。Na+、Mg2+、K+、Ca2+、Zn2+對(duì)紫甘藍(lán)花青素水提液的顏色穩(wěn)定性沒有產(chǎn)生顯著影響；Al3+對(duì)紫甘藍(lán)花青素提取液有明顯增色作用；Fe3+能直接使提取液變色；Fe2+、高濃度Cu2+則對(duì)紫甘藍(lán)花青素有明顯褪色作用[29]；而童丹對(duì)馬鈴薯花青素的研究中顯示Mg2+、Ca2+對(duì)色素的破壞作用較大[7]。張亦竹等[30]研究發(fā)現(xiàn)，一定質(zhì)量濃度（0.2 g/L）Zn2+的加入有助于提高圓茄子皮花青素的提取率。不同的是，張艷暉等[31]研究發(fā)現(xiàn)，Zn2+、Cu2+降低了紫色番茄花青素提取量，Ca2+、Mg2+、Na+、Mn2+、Al3+在提取過程中有保護(hù)和提高花青素提取量的作用。

4 結(jié)語與展望

近幾年，隨著越來越多種類花青素的發(fā)現(xiàn)，其作為天然色素在各種產(chǎn)品中的研究與應(yīng)用顯著增加。考慮到此類色素對(duì)健康的有益影響，將其納入食品和飲料行業(yè)具有重要價(jià)值。了解花青素分類、提取純化和鑒定方法，以及與金屬離子的相互作用對(duì)于花青素在工業(yè)中的應(yīng)用有重要的理論指導(dǎo)作用。富含花青素的原料的多樣性，花青素本身及衍生物的多樣性，為人們提供更多的研究和探索空間；不斷地優(yōu)化花青素生產(chǎn)加工工藝，將為著色劑在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)中控制成本方面提供科學(xué)方法；同一種金屬離子對(duì)不同食品原料中的花青素的提取率和穩(wěn)定性有的表現(xiàn)促進(jìn)作用，也有表現(xiàn)為抑制作用。國(guó)內(nèi)主要研究金屬離子對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響，對(duì)于其作用機(jī)制和原理少有報(bào)道。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，天然色素的提取、分離、鑒定和應(yīng)用在食品工業(yè)中會(huì)有更大的發(fā)展前景。