食品理化檢測實驗室的方法驗證

楊舒雅

寶雞市質量技術檢驗檢測中心，寶雞市質量技術檢驗檢測研究院（寶雞 721000）

方法驗證是實驗室管理體系中至關重要的一項工作，方法驗證過程受到人員、操作過程、儀器設備、試劑和標準物質、檢驗方法、實驗環境和設施等諸多因素的影響。從檢驗檢測機構現存問題來說，一方面，實驗室對方法驗證的重要性缺乏充分認識，沒有進行方法驗證，直接進入正式檢測程序，或者對方法驗證的概念和操作過程不夠理解，對方法驗證要素控制不規范等[1]，都會造成檢測結果的不確定性，這種不確定性給檢測結果帶來隱患；另一方面，從食品理化檢測的方法驗證國家標準來說，國家標準所涉及相關內容不多，也比較分散，對實驗室規范實施方法驗證造成一些困擾。所以認識方法驗證的重要性，正確實施方法驗證，對實驗室良好有效的運行有著重要意義。因此，從方法驗證的重要性、技術參數要素的控制[2-3]，結合實例，對實驗室進行方法驗證提出對策，為食品理化檢測實驗室進行方法驗證提供參考。

1 方法驗證的重要性

1.1 方法驗證的強制性

對于食品理化檢測實驗室來說，方法驗證是實驗室認可和資質認定時考核的一項重要內容，也是擴項時考查的一項重要環節，是檢驗檢測機構檢測能力的重要反映。不管是RB/T 214—2017《檢驗檢測機構資質認定能力評價檢驗檢測機構通用要求》，還是CNAS-CL01：2018《檢測和校準實驗室能力認可準則》，都對方法驗證做出明確要求，這是一個強制性的要求，也正說明方法驗證對實驗室質量控制的重要性。

CNAS-CL01：2018實驗室認可準則7.2.1.5規定[4]：實驗室在引入方法前，應驗證能夠正確地運用該方法，以確保實現所需的方法性能。如果發布機構修訂方法，應在所需的程度上重新進行驗證。RB/T 214—2017通用要求4.5.14規定[5]：檢驗檢測機構在使用標準方法前，應進行驗證。檢驗檢測機構應跟蹤方法的變化，并重新進行驗證。

1.2 方法驗證的必要性

明確方法驗證的概念。GB/T 27417—2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》[6]規定“方法驗證：實驗室通過核查，提供客觀有效證據證明滿足檢測方法規定的要求”，而RB/T 214—2017《檢驗檢測機構資質認定能力評價檢驗檢測機構通用要求》通用要求中“驗證”的概念為“提供客觀的證據，證明給定項目是否滿足規定要求”。所以方法驗證就是在采用新方法前或是標準方法發生更新后，進行新方法的證實，通過操作該方法證實是否滿足標準的要求，即證實該方法在現有或新購置儀器設備的性能和精度、檢測人員的能力、試劑和標準物質的等級及純度、操作程序的適用性、實驗室設施和環境等條件下能不能獲得令人滿意的檢測結果，分析該方法的適應性。只有方法驗證結論合格，才能運用該方法，進入正式檢測程序。因此方法驗證的過程就是證明采用該方法能否獲得準確可靠的檢測數據的過程，從而保證實驗室在采用該方法所需要的相關條件下，可以出具準確可靠的檢測結果。尤其對于對外提供檢測數據的檢驗檢測機構來說，方法驗證的重要性更是不言而喻的。

1.3 方法驗證對檢驗檢測結果的影響

在檢驗檢測工作中，檢測方法的適用性直接決定檢驗檢測數據的準確性。沒有經過方法驗證出具檢測結果，輕則造成檢測數據偏離，重則造成檢測結論出現錯誤，可能將合格產品判定為不合格，而不合格的判定結果會對企業的經營和聲譽造成惡劣影響，同時這種錯誤也會對檢驗檢測機構的公信力造成嚴重傷害。尤其是出現在一些涉及食品安全的執法檢測案件及仲裁檢驗等中，造成危害更大。所以有效進行方法驗證，不僅能確保數據準確可靠，提高檢驗檢測機構的檢測實力，而且會有效降低檢驗檢測機構工作風險，避免造成不良后果。

2 方法驗證的要素

2.1 線性及標準曲線

按照測定條件進行檢測時，若采用標準曲線進行定量分析，則標準溶液的濃度點在5個數據點以上（不包括空白）；濃度范圍一般在關注濃度的0～150%（含空白）[6]；對于準確定量的方法，線性回歸方程的相關系數r在0.99以上（包含0.99）[7]，對于篩選方法，線性回歸方程的相關系數r在0.98以上（包含0.98）[7]。不同濃度的標準溶液應獨立配制。待測組分含量不能超出標準曲線的工作范圍。若待測組分含量低于或高于標準曲線工作范圍，應采取加大或減少稱樣量，減小或增大樣品處理液稀釋倍數等方法，使其含量處于標準曲線工作范圍內。以酒類中展青霉素的測定為例，方法依據GB 5009.185—2016《食品安全國家標準食品中展青霉素的測定》（第二法）[8]，儀器采用島津SPD-20A高效液相色譜儀。以山楂酒為樣品基質，標準系列為5.00，10.0，25.0，50.0，100.0，150.0，200.0和250.0 ng/mL，測定結果為4.74，10.13，24.84，49.99，100.94，148.45，201.88和248.08 ng/mL，線性回歸方程為f（x）=0.001 678 62x+0.109 318，相關系數r=0.999 869 9，檢測結果符合要求。

2.2 檢出限和定量限

檢出限對于方法的測定范圍有重大意義。對于樣品中不允許存在的物質的檢測方法、定性檢測方法以及進行風險評估時，要驗證方法的檢出限。對于目標組分含量較低的檢測方法以及定量檢測方法，要驗證方法的定量限。若方法中已有方法檢出限或定量限（SMDL），則直接驗證該濃度水平，檢測結果應在SMDL±20%范圍內[9]。檢出限和定量限的驗證應采用同濃度水平的有證標準物質或標準溶液進行驗證。若方法未給出方法檢出限或定量限，應盡可能測試多種方法進行比較，采用合適的方法來測定檢出限或定量限。

檢出限的測定方法很多，有空白標準偏差法、信噪比法、逐步稀釋法等。依據方法所使用儀器的不同選擇適用的方法。以葡萄酒中赭曲霉毒素A含量測定為例，方法依據GB 5009.96—2016《食品中赭曲霉毒素A的測定》（第一法）[10]，儀器為Waters e2695高效液相色譜儀（2745檢測器）。試驗前對赭曲霉毒素A免疫親和進行柱效檢測，回收率為94.1%，則該批免疫親和柱滿足試驗要求。該方法給出酒類檢出限為0.1 μg/kg，則加入0.04 mL赭曲霉毒素A標準品（50ng/mL）于空白樣品中進行前處理，連續進行11次重復性測試，測試數據見表1。測定結果表明，11次重復性測試的偏差均在SMDL±20%范圍內，該方法的檢出限可達到標準要求，即該方法的檢出限為0.1 μg/kg。

表1 葡萄酒中赭曲霉毒素A檢出限的方法驗證數據（n=11）

2.3 正確度

檢測結果的偏倚通過回收率進行評估，即測定回收率可以進行正確度評估。有質控樣品的采用質控樣品進行正確度測試，沒有質控樣品的進行加標測定回收率來評估正確度。

2.3.1 回收率測定對檢測結果的影響

采用有證標準物質或符合要求的標準物質進行加標試驗，即在空白樣品基質中加入已知含量的標準物質進行測定，計算回收率。回收率的測定對定量分析非常重要，直接影響檢測結果的正確度。如在某次六六六、DDT盲樣（樣品基質為橙汁）考核檢測中，測得的數據為六六六28.8 μg/kg、DDT 57.1 μg/kg，而六六六滿意值范圍為32.5～80.5 μg/kg，DDT滿意值范圍為59.0～171 μg/kg，結果表明測定數據是偏離的。在分析數據偏離的原因時，在樣品處理環節，通過空白溶液加標進行樣品處理后測定回收率，回收率平均值為56%，低于60%～120%（目標組分含量＜0.1 mg/kg）的規定要求，所以回收率偏低造成數據偏離。由此可見，回收率測定對檢測數據影響較大。回收率的控制范圍見表2[7]。

表2 回收率控制范圍

2.3.2 回收率的測定

回收率測定時應至少進行低濃度、中間濃度、高濃度3個不同加標量的測試，每個濃度水平重復測定至少2次。對于有最高殘留量（MRL）限定，加標量在方法定量限或定量限附近、方法定量限和MRL之間、MRL的3個不同濃度水平進行回收率測定。以測定葡萄酒中紐甜含量為例，方法依據為GB 5009.247—2016《食品安全國家標準食品中紐甜的測定》[11]，儀器為島津SPD-20A高效液相色譜儀。經過檢測，樣品中紐甜含量2次重復性測試結果為0.000 156 g/kg和0.000 153 g/kg，而該方法定量限為0.000 2 g/kg，即樣品中紐甜含量小于定量限，可視為未檢出，所以采用在空白樣品中（該樣品可視為空白樣品）加入3個不同濃度水平標液進行加標測試，每個濃度水平進行2次重復性測試，葡萄酒中紐甜加標試驗（紐甜標液質量濃度100 μg/mL）的測試數據見表3。測定結果表明，回收率試驗符合方法驗證要求。

表3 葡萄酒中紐甜液相色譜法加標回收率的方法驗證數據（n=2）

2.3.3 回收率的討論

回收率好并不能保證方法的正確度，而回收率差肯定表明方法的正確度差。一般來說，若回收率低于60%～70%，應對方法重新改進，尤其是樣品前處理方法進行改進，從而提高回收率；若回收率大于110%，應對樣品進行更好的分離來排除各種干擾因素的影響。

2.4 精密度測試

精密度試驗包括重復性和再現性，分別用于衡量實驗室內和實驗室間精密度試驗的符合性，以下內容為實驗室內重復性精密度試驗。精密度通常以相對標準偏差（SRSD，%）表示。精密度測定時應進行低濃度、中間濃度、高濃度3個不同濃度水平的測試，每個濃度水平重復測定次數不少于6次。對于有最高殘留量（SMRL）限定，精密度試驗在方法檢出限、SMRL、選一合適點3個濃度水平進行測定。精密度試驗通過變異系數（C.V.）來評價，變異系數（相對標準偏差）按式（1）計算。

式中：C.V.為變異系數，%；S為標準偏差；Z為重復測定的平均值。變異系數控制范圍見表4[7]。

表4 實驗室內變異系數（C.V.）

以葡萄酒中紐甜的測定為例[11]，將3個不同濃度水平的標液加入空白樣品中，進行7次重復性測試，通過重復測定的平均值、標準偏差計算變異系數。葡萄酒中紐甜精密度測試數據見表5。測定結果表明，變異系數符合要求，即精密度方法驗證符合要求。

表5 葡萄酒中紐甜液相色譜法精密度的方法驗證數據（n=7）

3 結語

對于方法驗證參數的選擇，除了上述方法驗證要素以外，實驗室可根據現有的技術條件選擇盡可能多的技術參數。對于儀器檢出限的確定方法，國家標準未做明確規定，有待進一步研究。在日常檢測工作中，實驗室要根據標準的更新制定方法驗證計劃，由專業人員負責驗證計劃的實施和驗證報告的審核。不論是新標準方法的方法驗證，還是實驗室參加能力驗證或盲樣檢測等重要檢測活動，應按照方法驗證的要素控制試驗過程，使其符合相關規范要求，才能確保檢測數據準確可靠，從而有效提升實驗室檢驗檢測能力。