UPLC-MS/MS非衍生化法測定茶葉中草甘膦及其代謝產物

周茜，黃倩，堯聰，王紅，劉靜，呂漢清

1. 湖北省產品質量監督檢驗研究院（武漢 430061）；2. 嘉應學院生命科學學院（梅州 514015）

我國是茶葉的故鄉，也是茶文化的發源地。中國茶葉產量和飲用量均居世界第一[1]。隨著人們生活水平的提高，人們對茶葉品質的追求也越來越高，越來越多的人開始關注茶葉的質量安全問題[2]。影響我國茶葉質量安全的主要因素為農藥殘留超標、重金屬污染、非茶異物和粉塵污染。其中，農藥殘留問題最為突出。國際非政府環保綠色和平組織連續2年發布的茶葉農藥調查報告顯示，國內多家知名品牌茶葉中均有農藥殘留問題[3]。易守福等[4]于2019—2020年對湖南省14個地市的1 220批次茶葉開展農藥殘留情況調查。結果表明，592批次茶葉中檢出農藥殘留，檢出率為48.5%。檢出率較高的農藥主要是聯苯菊酯（38.7%）、多菌靈（36.0%）、啶蟲脒（32.8%）。由此可見，我國的茶葉農藥殘留問題不容忽視，監管和檢測工作仍然“任重而道遠”。

草甘膦，又稱農達，是全球生產和使用量最大的廣譜性除草劑[5]。草甘膦在農業生產上的不合理使用，其殘留及污染問題受到越來越多的關注。已有環境水樣、食品、土壤中檢出草甘膦的報道[6]。諸力等[7]對市售247份茶葉樣品進行篩查，草甘膦檢出率為18.7%。2015年，國際癌癥研究中心判定草甘膦具有遺傳毒性，它可以損壞DNA，對人類“可能致癌”。GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農藥殘留最大限量》中規定茶葉中草甘膦最大殘留限量為1 mg/kg。基于此，探究草甘膦殘留檢測方法具有重要現實意義。

草甘膦屬于氨基酸類除草劑，極性較大，不溶于一般有機溶劑，且其缺少生色團，難氣化，在C18色譜柱上無保留，使用常規手段直接分析時難度較大[8]，如：GB/T 23750—2009《植物性產品中草甘膦殘留量的測定 氣相色譜-質譜法》及文獻[9-10]中使用氣相色譜或氣相色譜串聯質譜檢測草甘膦時，需用七氟丁醇和三氟乙酸酐將草甘膦轉化為可氣化物質；SN/T 1923—2007《進出口食品中草甘膦殘留量的檢測方法液相色譜-質譜/質譜法》及文獻[11-13]中使用液相色譜串聯質譜檢測草甘膦時，常將其與9-芴甲氧羰酰氯衍生以增強其在色譜柱上的保留及儀器響應程度。然而，衍生化反應存在操作復雜、衍生試劑昂貴、衍生副產物易污染儀器、重現性差等缺點[14-16]。使用親水性色譜柱可以增強草甘膦在色譜柱上的保留，實現草甘膦的直接測定[17-18]。但草甘膦與植物中的有機物有很強的結合力。檢測茶葉中的草甘膦時，易受茶葉基質中的色素、生物堿、多酚等的干擾[19]。現有非衍生測定法中多采用固相萃取法進行富集凈化，實際消耗量大，操作繁瑣，后續的氮吹旋蒸等濃縮步驟易造成會回收率不穩定[20]。試驗針對茶葉樣品，開發一種無需衍生、凈化步驟簡單、快速測定草甘膦及其代謝產物氨甲基膦酸殘留量的分析方法，以期為建立植物源性食品中草甘膦及其代謝產物的快速檢測方法提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

超高效液相色譜三重四極桿質譜聯用儀（UPLC I-Class Xevo TQ-XS，美國沃特世公司）；刀式研磨儀（GM200，德國萊馳公司）；多管渦旋振蕩器（UMV-2，北京優晟聯合科技有限公司）；高速離心機（Avanti J-15R，美國貝克曼庫爾特有限公司）；十萬分之一天平（XSE205DU，瑞士梅特勒-托利多集團）。

1.2 試劑與材料

乙腈、乙酸銨、氨水（均為色譜純，美國Tedia公司）；水為去離子水；草甘膦、氨甲基膦酸標準品（純度不低于97.5%，美國AChemTek Inc.公司）；草甘膦專用柱（ProElut GLY 6 mL，北京迪科馬科技有限公司）。

茶葉樣品（購自當地超市）。

1.3 標準溶液配制

準確稱取10 mg（精確至0.1 mg）草甘膦、氨甲基膦酸固體標準物質，分別用超純水溶解（加2滴鹽酸，確保其全部溶解），并配制成質量濃度100 mg/L的標準儲備液，于4 ℃避光保存，有效期為12個月。混合標準中間液和工作溶液：將上述標準儲備液用超純水逐級稀釋，現配現用。

1.4 超高效液相色譜-串聯質譜條件

色譜柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相A為20 mmol/L甲酸銨水溶液（含1%氨水）；流動相B為乙腈；梯度洗脫條件見表1。柱溫40 ℃；進樣量1.0 μL。

表1 梯度洗脫程序

質譜電離模式：電噴霧離子化（ESI-）；霧化氣采用氮氣；毛細管電壓2.4 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度600 ℃；脫溶劑氣流速1 000 L/h；噴霧氣壓力7 bar；掃描模式采用多反應監測掃描（MRM）；其他質譜參數見表2。

表2 質譜參數

1.5 樣品前處理

取200 g代表性茶葉樣品，粉碎，過孔徑2.0 mm篩，裝入潔凈容器，密封干燥保存。

稱取1 g（精確至0.01 g）均勻茶葉篩后試樣，置于50 mL塑料離心管中，加10 mL水、10 mL二氯甲烷，渦旋30 s后，振蕩10 min，按4 000 r/min離心5 min。取5 mL上清液，過ProElut GLY柱，棄去前3 mL流出液，接收后2 mL流出液，過0.22 μm尼龍濾膜，UPLC-MS/MS測定。

2 結果與討論

2.1 液相色譜條件優化

采用非衍生法測定草甘膦類化合物時，液相色譜條件的選擇最為關鍵。試驗選用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱，固定相是與100%水溶液流動相兼容的C18固定相，對極性化合物有較好的保留能力。考察20 mmol/L甲酸銨-甲醇、20 mmol/L甲酸銨-乙腈、20 mmol/L甲酸銨（含0.1%甲酸）-乙腈、20 mmol/L甲酸銨（含0.1%氨水）-乙腈4種流動相對草甘膦的分離及響應程度的影響。在不同流動相條件下，草甘膦的提取離子流圖見圖1。結果表明，與甲醇相比，采用乙腈作為有機相時，草甘膦響應值更高，峰形更好。此外，流動相中20 mmol/L甲酸銨含有0.1%氨水時，草甘膦的峰的分離度和響應值最好。這可能是由于試驗中草甘膦在負離子模式下測定，而草甘膦解離常數為pKa1=2.3、pKa2=5.7、pKa3=10.9，在堿性條件下更有利于其電離且增強其在T3柱上的保留。因此，試驗選擇20 mmol/L甲酸銨水溶液（含1%氨水）-乙腈作為流動相。在優化條件下，草甘膦及氨甲基膦酸的TIC圖及提取離子流圖見圖2。

圖1 不同流動相條件下，草甘膦的提取離子流圖

圖2 草甘膦及其代謝產物氨甲基膦酸的總離子流圖和提取離子流圖

2.2 樣品凈化方式的選擇

茶葉基質中含大量色素、生物堿、多酚等雜質，會影響草甘膦檢測結果的準確性。試驗中以空白綠茶為基質，向其中加入50 μg/kg的草甘膦及氨甲基膦酸混合標準溶液，考察ProElut GLY、CAX、HLB、C18這4種固相萃取小柱對測定結果的影響。結果表明，與CAX、HLB、C18這3種需活化和洗脫的固相萃取小柱相比，ProElut GLY凈化后流出液呈淡綠色，且目標化合物有較高的回收率，說明ProElut GLY能有效去除基質干擾，且不會影響目標化合物的測定。ProElut GLY在使用時無需活化、淋洗和洗脫，流出液可直接上機檢測，可大幅縮減樣品前處理時間。故試驗選擇ProElut GLY小柱對樣品進行凈化處理。

2.3 方法學驗證

為減小茶葉基質的抑制效應，試驗配制空白茶葉基質標準曲線，按優化后檢測條件進行，以質量濃度（μg/L）為橫坐標，各定量離子對應的儀器響應值為縱坐標，繪制標準曲線。草甘膦及氨甲基膦酸的線性方程及相關系數見表3。2種化合物在1～1 000 μg/L范圍內呈現良好的線性關系，相關系數r2均大于0.99。通過向空白茶葉基質提取液添加低水平的標準溶液，以3倍信噪比對應的含量作為方法的檢出限。結果表明，該方法靈敏度高，檢出限遠低于GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》中草甘膦限量標準（1.0 mg/kg），可滿足茶葉中草甘膦及其代謝物快速篩查的需求。

表3 茶葉基質中2種化合物的線性范圍、線性方程、相關系數和方法檢出限

為評價方法的準確性，試驗向空白茶葉基質中，分別添加0.1，0.2和0.5 mg/kg的混合標樣，按照上述方法提取凈化后，平行測定5次，計算方法的回收率和相對標準偏差。由表4可知，在茶葉基質中，3個添

表4 2種化合物的加標回收率和相對標準偏差（n=5）

加水平下兩種化合物的回收率范圍為89.3%～102.4%，相對標準偏差小于8.3%。方法的準確性和精密度均滿足定量分析要求。

2.4 實際樣品檢測

利用試驗方法對湖北省市場上的243批茶葉樣品進行分析。結果顯示，草甘膦檢出率為30.5%，不合格率為8.2%。在合格樣品中，草甘膦質量分數范圍為0.16～0.84 mg/kg。不合格樣品中草甘膦超標比較嚴重，最高可超限量37倍。這說明市場上草甘膦濫用現象比較普遍，應加強監管力度。

3 結論

試驗建立一種使用UPLC-MS/MS檢測茶葉中的草甘膦及其代謝產物氨甲基膦酸的非衍生分析方法。樣品用超純水提取后，經ProElut GLY凈化后，可直接上機檢測，采用負離子MRM測定，外標法定量。2種目標分析物在優化的方法下具有良好的線性關系、較高的回收率和較好的精密度。方法操作簡單，檢測快速，可用于茶葉樣品中草甘膦類化合物的批量檢測。