藤茶植物TLC鑒別方法及指紋圖譜的建立

凌偉紅，陳燕，馮淼，王超純，田春蓮

1. 吉首大學林產化工工程湖南省重點實驗室（張家界 427000）；2. 張家界市永定區農業農村局（張家界 427000）

藤茶是由葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentataW.T.Wang）的莖葉加工而成的類茶，又名莓茶、白茶、甘露茶，作為保健茶和中草藥已有數百年的應用歷史[1-3]，具有治療黃疸、咽喉腫痛和抗動脈粥狀樣硬化等功效[4-5]，其二氫楊梅素、楊梅素和楊梅苷是藤茶主要的活性物質[6]，具有抗氧化、抑菌、解酒護肝等活性[7-9]。此外，在2019年新冠肺炎疫情中，張家界市人民醫院以藤茶為主藥預防和治療新冠肺炎的效果顯著[10]。

但羽葉蛇葡萄和廣東蛇葡萄嫩莖葉也用于制作“藤茶”，這導致市場上同名不同品，同品不同名的現象，因此，需要一種高效快速的方法來辨別原料，而TLC以高效便捷、分析成本低的優勢在中草藥鑒定、食品安全等領域被廣泛應用，如沙棘、金銀花、麥冬的品質評價中均有報道[11-13]，藤茶TLC在湖南、福建和廣西地方標準均采用不同的薄層展開體系，另有何桂霞等[14-15]以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（10∶8∶5）為展開劑對藤茶楊梅素和二氫楊梅素定量分析，但展開劑中均使用了易制毒試劑，這限制了TLC在藤茶原料植物評價中的應用。此外，應用TLC評價不同品種與不同區域的藤茶原料植物鮮有報道。因此，此次試驗在優化TLC條件的基礎上評價不同區域藤茶原料植物的優劣，以期為藤茶原料的質量評價提供有效便捷的檢測技術。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

DSA300-GL1型超聲波清洗儀（福州德森精工有限公司）；ATS4薄層色譜自動點樣儀和TLC Visualizer 2薄層成像儀（瑞士卡瑪公司）；GF254薄層板（乳山市太陽干燥劑有限公司）；FA1004萬分之一電子天平（上海舜宇恒平儀器有限公司）；GLM101型鼓風干燥箱（武漢格萊莫檢測設備有限公司）。

二氫楊梅素（純度≥98%，批號20190610，中國生物制品檢定所）；楊梅素（純度≥98%，批號L1623059，上海麥克林生化科技有限公司）；楊梅苷（純度≥98%，批號202012-201218，中原植提標準品實驗耗材中心）；石油醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸、甲酸（均為分析純）；水（自制超純水）。樣品2021年5—6月采自湖南、湖北、廣西、云南四省16個不同產地的66個藤茶原料嫩莖葉，經吉首大學廖博儒研究員鑒定S51為羽葉蛇葡萄，S52、S54為廣東蛇葡萄，其他均為顯齒蛇葡萄，取其5～7 cm嫩莖葉，經50 ℃烘箱干燥，粉碎并過0.425 mm（40目）孔徑篩，常溫干燥備用。樣品采集時間及編號見表1。

表1 顯齒蛇葡萄和其近緣植物樣品信息

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

準確稱取0.2 g樣品干燥粉末，參照汲軍等[16]藤茶超聲提取黃酮工藝，并稍作修改。加10 mL提取溶劑，于60 ℃超聲提取30 min，加提取溶劑補足至10 mL，經0.45 μm有機膜過濾，放置4 ℃冰箱中避光保存。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取適量楊梅素、二氫楊梅素和楊梅苷對照品，分別以50%甲醇溶解定容至10 mL，制成質量濃度分別為0.24，0.11和0.23 mg/mL的對照品溶液；精密量取適量楊梅素、二氫楊梅素和楊梅苷對照品溶液，以50%甲醇溶解并定容至10 mL，制成質量濃度分別為0.30，0.13和0.23 mg/mL的混合對照品溶液，于4 ℃避光保存。

2.3 TLC條件考察

2.3.1 不同展開劑的考察

比較甲醇-水（1∶1，V/V）[17]、甲醇-醋酸-水（90∶5∶5，V/V）[18]、乙醇-水-甲酸（3∶3∶1，V/V）[19]、石油醚-乙酸乙酯-甲酸（17∶13∶0.3，V/V）[20]4種展開劑，結果發現前3種展開時間長，溶劑前沿連成一線且斑點數量少，而石油醚-乙酸乙酯-甲酸（17∶13∶0.3，V/V）展開效果較好，但此展開劑下二氫楊梅素和楊梅苷的比移值（Rf）較低，不利于觀察。因此試驗考慮加入適量正丁醇調節甲酸比例以優化展開體系。

2.3.2 展開劑比例的考察

配制展開體系：①石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（17∶13∶2∶0.5，V/V）；②石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（17∶13∶2∶1，V/V）；③石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（17∶13∶2∶1.5，V/V）；④石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（17∶13∶2∶2，V/V）；⑤石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（17∶13∶2∶2.5，V/V），在室溫下飽和15 min后分別吸取5 μL供試液點在硅膠GF254薄層板上，分別在上述3種不同展開系中展開，取出，晾干，噴1% AlCl3乙醇溶液，熱風吹干，于365 nm檢視。結果顯示，展開系統①，②和⑤的分離效果不如展開系統③和④，展開系統③條帶更為清晰，因此，選擇展開系統③作為藤茶原料植物薄層鑒別的展開劑。

2.3.3 顯色劑的選擇

取37號供試品溶液及混合對照品溶液，各5 μL，點在高效硅膠 GF254薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（17∶13∶2∶1.5，V/V）為展開劑，展開，分別用不同顯色劑進行顯色。①10%硫酸乙醇溶液顯色。將展開后的薄層板浸入10%硫酸乙醇溶液，取出晾干后于80 ℃加熱至斑點顯現，置紫外燈（365 nm）下視檢。②1% AlCl3乙醇溶液顯色。噴1% AlCl3溶液至薄層板，熱風吹干，置紫外燈（365 nm）下視檢。③10%磷鉬酸溶液顯色。將展開后的薄層板浸入10%磷鉬酸溶液，取出晾干后于80 ℃加熱至斑點顯現，置白光下視檢。 結果表明，在紫外燈視檢下，1% AlCl3乙醇溶液顯色后能單獨檢視所有的特征條帶，而10%磷鉬酸溶液和10%硫酸乙醇溶液視檢需加熱顯色，操作不便，加熱終點難以控制，條帶不清晰，不便于觀察，故選擇1% AlCl3乙醇溶液為顯色劑。

2.3.4 提取溶劑的考察

選擇50%，80%，100%甲醇和75%，95%，無水乙醇為提取溶劑，按照2.1.1小節的方法制備相應供試液，分別取5 μL供試液，依次點樣在同一薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（17∶13∶2∶1.5，V/V）為展開劑，上行展開，取出，晾干，噴1%AlCl3乙醇溶液，熱風吹干，于365 nm視檢。結果顯示，50%甲醇提取的供試液薄層圖譜色素斑點少，而100%甲醇提取的供試液TLC圖斑點清晰，其他溶劑提取差異不明顯。因此，選100%甲醇為顯齒蛇葡萄活性成分的提取溶劑。

2.3.5 點樣量的考察

分別吸取2，4，6，8，10和12 μL的供試液以6nm為點樣寬度在同一薄層板上點樣，以石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（17∶13∶2∶1.5，V/V）為展開劑，上行展開，點樣量2 μL時楊梅素條帶未顯出，說明點樣量少，其楊梅素含量達不到檢出限，而點樣量超過6 μL時條帶出現，但條帶邊界不清晰，楊梅苷與楊梅素開始拖尾，所以點樣量為5 μL。

2.3.6 點樣寬度的考察

吸取5 μL供試液，分別以3，4，5，6，7和8 mm為點樣寬度在薄層板上點樣，展開顯色后，在365 nm紫外光下觀察，結果發現不同點樣寬度對樣品分離效果有影響，點樣寬度在5，6和7 mm處條帶較清晰，點樣寬度增加，條帶逐漸模糊。故選擇6 mm為最佳點樣寬度。

2.3.7 展開溫度的考察

將3塊點有樣品的薄層板分別放入在4 ℃，40 ℃與室溫的展開缸中，上行展開，顯色觀察。試驗表明，40 ℃薄層板展開時間長且邊界模糊，4 ℃低溫下展開條帶更為分明，但展開時間長，且圖譜與室溫下展開的區別不大，因此試驗在室溫下進行即可。

2.3.8 展開濕度的考察

在上述確定的TLC條件下，使用不同濃度的硫酸水溶液控制層析缸濕度，即展開缸內相對濕度控制在30%，40%，50%和60%。將點有供試液的4塊薄層板分別在不同濕度下展開，結果發現濕度區間內薄層斑點的Rf值變化不大，故薄層展開濕度在30%～60%均可進行，無須嚴格控制濕度。

2.3.9 穩定性考察

按2.1.1小節制備樣液，每隔2 h點樣1次，分別在制備樣液后的0，2，4，6和8 h后點樣于同一薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（17∶13∶2∶1.5，V/V）為展開劑展開，顯色后在365 nm下檢視，結果發現此時間內樣品TLC無明顯變化，說明樣品液穩定性較好。

2.4 不同省份顯齒蛇葡萄的TLC鑒別

采用已建立的TLC最佳條件評價來自湖南、湖北、廣西、云南4 省份的顯齒蛇葡萄樣本，結果如圖1所示。在供試品溶液色譜圖中，樣品與對照品顯現相同顏色熒光斑點的位置相對應。對不同地區而言，云南（S14～S15）二氫楊梅素明顯低于其他地區，在楊梅苷與二氫楊梅素間無其他條帶，楊梅素與二氫楊梅素間未出現藍色條帶，而廣西（S16～S17）在Rf=0.2處出現暗黃色條帶，Rf=0.53處可見藍色未知成分條帶，推測廣西藤茶原料植物的化學成分較為豐富。湖南、湖北兩省所采樣品的化學成分相近，二氫楊梅素含量明顯高于其他省份，其中湖北樣品大約在Rf=0.51處藍色熒光斑點明亮，湖南同一產區顯齒蛇葡萄中楊梅素條帶亮度隨海拔升高而增強，如S18～S20采自海拔380～1 103 m的湖南雙牌，以S19楊梅素條帶亮度最強。因此，TLC可客觀評價不同省份的顯齒蛇葡萄資源。

圖1 不同省份顯齒蛇葡萄的TLC

2.5 顯齒蛇葡萄及近緣植物的TLC鑒別

選擇不同品種藤茶原料樣品進行TLC鑒別。S48～S50為3家館種植的大葉莓、小葉莓和白莓。S51～S54為湖北來鳳產區，在供試品色譜中，S51，S52和S54楊梅素斑點未顯現出，S51約在Rf=0.8處多1個黃色熒光斑點，楊梅苷上方多1個藍色熒光斑點，二氫楊梅素斑點未顯現。S48，S49，S50和S53楊梅素、二氫楊梅素、楊梅苷均有對應斑點，其中S48大葉莓中楊梅苷亮度明顯低于其他樣品，S49小葉莓二氫楊梅素斑點最大，在Rf=0.21處淡黃色熒光斑點亮度呈現為大葉莓＜小葉莓＜白莓。S48～S50均在Rf=0.1處有藍色熒光斑點，廣東蛇葡萄S52與S54呈現出相同顏色的斑點且斑點數相同。

2.6 湖南湘西產區顯齒蛇葡萄的TLC鑒別

采用2.3小節的方法評價39批湖南湘西不同區域的顯齒蛇葡萄樣品，結果如圖2所示。以各共有峰的峰面積為指標，采用ChemPattern軟件，進行PCA并選方差貢獻率較大的2個主成分聚類分析，得圖4（圖4中樣品序列號對應圖3中樣品軌道序列）。由圖4（A）發現，除S44、S46、S62外的36批樣品分為2類，其中S36，S38，S39，S65和S66為Ⅰ類，其他樣品為Ⅱ類，地理位置越近，樣品聚集度越高。3個主成分中，PC1=25.07%，PC2=18.79%，PC3=16.82%，共占比60.68%。從圖4（B）可看出，三家館、青安坪、羅塔坪、王家坪均聚集在一起，說明這4個產區的原料質量穩定。沅古坪、王家坪和溫塘產區內差異大，可能與區域內環境有關，教字埡PC1成分差異明顯，應該由產區海拔引起，200～500 m之間海拔越高，PC1含量越高。總之，所有樣品均富含二氫楊梅素、楊梅素及楊梅苷，其中以S44、S61樣品中楊梅素含量明顯高于其他產區，S46號樣品二氫楊梅素明顯高于其他產區，可以推斷湘西地區由于地勢地貌差異大、海拔等因素不同對顯齒蛇葡萄的化學成分含量存在一定的影響。

圖2 不同品種藤茶原料的TLC

圖3 湖南湘西地區顯齒蛇葡萄的TLC

圖4 湖南湘西地區顯齒蛇葡萄的TLC聚類分析（A）與主成分分析（B）

2.7 顯齒蛇葡萄TLC共有模式的確定

藤茶原料植物的薄層分析圖導入ChemPattern軟件，手動設定軌道，調節軌道位置和寬度，將圖形轉化為灰度曲線，得到疊加圖譜和共有模式，根據Rf值確定6個樣品共有峰，生成疊加圖譜并形成共有模式（如圖4所示）。不同產區峰面積的SRSD值相差較大（均＞3%），由于藤茶的地理來源、生長的環境和管理模式不盡相同，因此呈現出活性成分的含量與種類差異較大，而對于相同品種和相同地理來源的藤茶活性成分是相近的。故TLC指紋圖譜可作為藤茶原料的質量控制方法。

圖5 藤茶原料植物TLC指紋圖譜

3 討論與結論

3.1 討論

黃酮成分是藤茶原料植物的主要活性成分，而植物活性成分的積累與其生長環境密切相關，對不同區域及不同種屬的藤茶原料植物開展TLC鑒定，尤其重點分析湘西地區的顯齒蛇葡萄。試驗發現地區、品種差異對黃酮成分影響顯著。根據樣品薄層色譜的斑點峰面積和Rf，建立的TLC指紋圖譜可快速鑒別不同的藤茶原料植物，為藤茶的品質鑒定和質量評價提供依據。試驗同時指認3種黃酮成分，展開體系中加入正丁醇能很好地分離顯齒蛇葡萄黃酮，有別于傳統的氯仿/甲苯/丙酮易制毒、毒性大的展開溶劑且僅鑒別2種黃酮成分[21-23]。此外，采用的化學計量學方法評價TLC數碼輪廓具有定性與定量結合的優勢，且聚類分析與PCA分析結果基本一致。TLC鑒別多使用對照品識別樣品條斑對應的成分，可通過TLC了解藥材中更多的化學成分，通過薄層-質譜技術推測條斑對應成分的結構。

3.2 結論

試驗建立以石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（17∶13∶2∶1.5，V/V）為展開劑，飽和時間15 min，點樣量5 μL，點樣寬度6 mm，室溫下的藤茶原料植物TLC鑒別方法。TLC圖譜中Rf=0.075，Rf=0.58和Rf=0.63處顯示清晰可見的黃色熒光斑點，分別與對照品楊梅苷、二氫楊梅素和楊梅素的斑點的Rf值相對應，且條帶之間無影響，樣品斑點清晰，分離較好，Rf值適中。所建立的TLC方法簡便快速、結果直觀，非常適合實際生產中大量樣品的檢測。但環境濕度、展開劑飽和程度等易導致Rf變動，在有對照品參照下對鑒別的影響較小。

66批樣品薄層分析發現，相同產地、不同海拔的顯齒蛇葡萄化學成分差異不明顯，而楊梅素的含量隨海拔增加而增加，不同省份的顯齒蛇葡萄黃酮含量存在明顯差異，高低順序為湖南＞廣西＞云南。不同蛇葡萄屬植物黃酮含量呈現為顯齒蛇葡萄＞廣東蛇葡萄＞羽葉蛇葡萄。