氣相色譜-氫火焰離子檢測(cè)器測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中OPO含量

施豪

上海源本食品質(zhì)量檢驗(yàn)有限公司（上海 200090）

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人們的生活水平不斷提高，嬰幼兒食品消費(fèi)量越來(lái)越高，尤其是嬰幼兒配方奶粉。母乳是自然界中對(duì)嬰兒最好的食物，無(wú)論是營(yíng)養(yǎng)成分還是免疫功能，對(duì)嬰兒發(fā)育都有重要作用。但由于各種原因無(wú)法進(jìn)行母乳喂養(yǎng)，于是許多家庭選擇嬰幼兒配方奶粉替代[1]。隨著每年國(guó)內(nèi)消費(fèi)量逐步增加，嬰幼兒配方奶粉的品牌也更加廣泛。

在嬰幼兒奶粉中，主要以甘油三酯提供嬰兒生長(zhǎng)所需的脂肪酸，約占98%[1-2]，同時(shí)脂肪作為能量的來(lái)源，可以提供等量蛋白質(zhì)或碳水化合物2倍以上的熱量，為成長(zhǎng)中的嬰幼兒提供50%～60%的能量[3]。母乳中含有3%～5%的脂肪，其中的18%～25%是1, 3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（1, 3-dioleoyl-2-palmitoyl glycerol，OPO）[4]。OPO在sn-2位上為棕櫚酸，這一特殊結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)嬰幼兒對(duì)脂肪酸以及營(yíng)養(yǎng)上的吸收，提供足夠能量，并能夠避免鈣質(zhì)皂化引起的缺鈣和便秘[5]，完善骨骼強(qiáng)化及腸胃成熟[6]。因?yàn)镺PO所具有成分的特殊性，許多科研者都針對(duì)嬰幼兒食品中脂肪進(jìn)行研究工作。

OPO作為一種結(jié)構(gòu)脂，2008年原衛(wèi)生部批準(zhǔn)嬰幼兒配方奶粉中可添加OPO作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，并且明確規(guī)定其在生產(chǎn)技術(shù)指標(biāo)及強(qiáng)化量[6]。2015年發(fā)布的GB 30604—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯》規(guī)定食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑中1, 3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（OPO）的檢測(cè)方法。但是迄今為止，國(guó)內(nèi)尚未制定嬰幼兒配方奶粉中OPO的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，而大量國(guó)內(nèi)外奶粉生產(chǎn)企業(yè)逐步將添加OPO的嬰幼兒配方奶粉商品推入市場(chǎng)，因此建立嬰幼兒配方奶粉中OPO檢測(cè)方法迫在眉睫。

試驗(yàn)旨在建立一種測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中OPO的定量方法，以滿足現(xiàn)在嬰幼兒配方奶粉市場(chǎng)的需求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料及試劑

1, 3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（OPO）標(biāo)準(zhǔn)品（貨號(hào)SA-D-1657，純度≥99%，美國(guó)Sigma公司）；十七烷酸甘油三酯（C17∶0）標(biāo)準(zhǔn)品（貨號(hào)SA-T2151，純度≥99%，美國(guó)Sigma公司）；正己烷（色譜純，美國(guó)默克公司）；氨水（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；石油醚、無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醚（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；超純水。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

安捷倫6890N氣相色譜儀（帶氫火焰離子化檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技公司）；BS210S電子天平（精度0.000 1 g，德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；OSB-2200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會(huì)社EYELA）；HHS電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；AC1600A冷卻液循環(huán)機(jī)（北京同洲維普科技有限公司）；GM-0.50隔膜真空泵（天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 分析方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱DB-1HT彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.1 μm，美國(guó)安捷倫科技公司）；進(jìn)樣口溫度320 ℃；檢測(cè)器溫度380 ℃；升溫程序：初始柱溫300℃，保持3 min，以20 ℃/min升溫至380 ℃，保持15 min；載氣采用氮?dú)猓兌取?9.999%）；流速0.6 mL/min；空氣流量350 mL/min；氫氣流量35 mL/min；分流比5∶1；進(jìn)樣量1.0 μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

OPO標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（2.0 mg/mL）：稱取50 mg OPO標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL容量瓶中，加入正己烷，定容至刻度，搖勻。

十七烷酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液（5.0 mg/mL）：稱取50 mg十七烷酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，加入正己烷，定容至刻度，搖勻。

OPO標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：分別吸取0，0.10，0.25，0.50，1.00和1.25 mL OPO標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（2.0 mg/mL）于10 mL容量瓶中，并加入0.20 mL十七烷酸甘油三酯（C17∶0）內(nèi)標(biāo)溶液，用正己烷定容至刻度，搖勻。此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線OPO的質(zhì)量濃度分別為0，0.02，0.05，0.10，0.20和0.50 mg/mL；十七烷酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液（C17∶0）的質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL。

1.2.3 試樣處理

稱取2 g（精確至0.000 1 g）奶粉樣品于50 mL具塞比色管中，加入8 mL水，加熱溶解后，加入2 mL氨水，搖勻后將具塞比色管放入65 ℃±5 ℃的恒溫水浴鍋中，加熱15 min，每5 min取出振蕩1次。水解完畢后取出，冷卻至室溫。加入10 mL乙醇混合后，轉(zhuǎn)移至125 mL分液漏斗中；加入25 mL無(wú)水乙醚，塞上瓶塞，振蕩1～2 min；加入25 mL石油醚，繼續(xù)振蕩1 min；分液漏斗靜置至上層有機(jī)相與下層水相明顯分離。將下層水相放入水解樣品的比色管中，上層有機(jī)相倒入圓底燒瓶中。重復(fù)上述操作步驟，將合并2次有機(jī)相的圓底燒瓶，置于水浴溫度50 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)，在負(fù)壓條件下，將溶劑旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用5 mL正己烷將圓底燒瓶中的脂肪反復(fù)洗入25 mL容量瓶中，加入0.5 mL十七烷酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液（5.0 mg/mL），用正己烷定容至刻度后，搖勻。倒入進(jìn)樣瓶中，供GC分析。

1.3 結(jié)果計(jì)算

樣品中OPO含量按式（1）進(jìn)行計(jì)算。

式中：X為樣品中OPO含量，g/100 g；C為從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的待測(cè)液中OPO質(zhì)量濃度，mg/mL；V為樣品定容體積，mL；m為試樣質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件選擇與優(yōu)化

氣相色譜主要依靠色譜柱、初始柱溫與升溫程序達(dá)到被測(cè)物質(zhì)的有效分離。而分離度（R值）作為色譜中分離效能指標(biāo)，其定義是相鄰2個(gè)組分的色譜峰保留值之差與2個(gè)組分色譜峰的峰底寬總和之半的比值[9]。當(dāng)R≥1.5時(shí)可以認(rèn)定相鄰2個(gè)峰完全分開(kāi)。參考GB 30604—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑1, 3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯》[8]中對(duì)OPO的測(cè)定，按照方法中的色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，即恒壓模式；進(jìn)樣口溫度320 ℃；升溫程序：初始柱溫300 ℃，保持3 min，以20 ℃/min升溫至380 ℃，保持10 min。方法中參考的檢測(cè)器溫度為370 ℃，考慮到升溫程序最后達(dá)到的柱溫為380 ℃，檢測(cè)器溫度一般不低于升溫程序中的最高柱溫，而且檢測(cè)器溫度低于柱溫時(shí)可能導(dǎo)致有機(jī)物沉積，使得檢測(cè)器的相應(yīng)值降低，因此最終選擇的檢測(cè)器溫度為380 ℃，流比為5∶1。

如圖1所示，在恒定壓力的條件下，內(nèi)標(biāo)十七烷酸甘油三酯和被測(cè)物OPO，雖然在色譜圖上出峰時(shí)間較早，峰型較好，但是在2種物質(zhì)的出峰時(shí)間相近，并且從標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度點(diǎn)0.10 mg/mL開(kāi)始，分離度未達(dá)到1.5，不能得到很好的分離效果。

圖1 恒定壓力下C17∶0（0.10 mg/mL）和OPO（0.10 mg/mL）的色譜圖

因此，在恒定流量的模式下，流量1.0 mL/min，采用相同的升溫程序進(jìn)樣分析，如圖2所示，C17∶0和OPO的分離度有所改善，但2種物質(zhì)的出峰時(shí)間依舊達(dá)不到理想的分離效果。

圖2 恒定流量（1.0 mL/min）下C17∶0（0.10 mg/mL）和OPO（0.50 mg/mL）的色譜圖

所以，在恒定流量的模式下，選擇流量0.6 mL/min，采用相同的升溫程序進(jìn)樣分析，如圖3所示，C17∶0和OPO的峰形較好，分離度為5.2，達(dá)到基線分離的效果。故最終流量選擇0.6 mL/min。

圖3 恒定流量（0.6 mL/min）下C17∶0和OPO（0.50 mg/mL）的色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將5個(gè)質(zhì)量濃度的OPO標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液（0，0.02，0.05，0.10，0.20和0.50 mg/mL）按上述的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄C17∶0和OPO的色譜峰面積。以O(shè)PO的濃度為橫坐標(biāo)，C17∶0和OPO的峰面積比值為縱坐標(biāo)，使用儀器自動(dòng)積分，自動(dòng)繪成標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖4所示，回歸方程y=0.744 738x-0.005 633，相關(guān)系數(shù)為0.999 1。根據(jù)GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[10]中附錄F.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求，該標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍已覆蓋1個(gè)數(shù)量級(jí)，并且除空白外選擇5個(gè)濃度點(diǎn)，線性回歸方程的相關(guān)線性也大于0.99，因此，在上述色譜條件下測(cè)得的OPO在質(zhì)量濃度0.02～0.50 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖4 奶粉1的C17∶0和OPO色譜圖

2.3 精密度和重現(xiàn)性

按試驗(yàn)方法的色譜條件對(duì)2種OPO含量不同的嬰幼兒配方奶粉樣品重復(fù)測(cè)定6次，并取6次的平均值計(jì)算出精密度（SRSD），結(jié)果如表1所示。奶粉樣品1的SRSD值為1.30%，奶粉樣品2的SRSD值為1.27%。試驗(yàn)證明該方法的精密度和重現(xiàn)性良好。

表1 2種不同嬰幼兒配方奶粉樣品下得出的精密度（SRSD）

2.4 回收率

選取奶粉樣品2（準(zhǔn)確稱取2 g）為本底，分別選擇1.0，1.6和2.0 mg 3個(gè)點(diǎn)作為加標(biāo)濃度，即OPO標(biāo)準(zhǔn)品的理論添加量分別為0.05，0.08和0.100 g/100 g，每個(gè)濃度進(jìn)行6次加標(biāo)回收試驗(yàn)。如表2所示，試驗(yàn)方法的加標(biāo)回收率范圍為96.0%～104.0%，回收率穩(wěn)定。

表2 嬰幼兒配方奶粉不同回收率

3 結(jié)論

繪制以C17∶0作為內(nèi)標(biāo)的1, 3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（OPO）標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用DB-1HT彈性石英毛細(xì)管柱，采用氣相色譜-氫火焰離子檢測(cè)器（GCFID），在恒定流量0.6 mL/min條件下，OPO和C17∶0分離度為5.2，能夠?qū)⒛繕?biāo)物質(zhì)OPO、C17∶0和其他甘油三酯有效地分離。

試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)方法的精密度和重現(xiàn)性良好，SRSD最大值為1.30%，回收率范圍為96.0%～104.0%。隨著市場(chǎng)上出現(xiàn)越來(lái)越多添加OPO的嬰幼兒配方奶粉，在國(guó)內(nèi)在沒(méi)有制定嬰幼兒奶粉中OPO檢測(cè)方法的情況下，該方法可以對(duì)嬰幼兒配方奶粉中的OPO進(jìn)行準(zhǔn)確的定量測(cè)定，以滿足市場(chǎng)需求和保證食品安全。