UPLC-MS/MS測定羊奶中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考

董梅，李璐，羅葉麗，尚衛，陳子龍，張艷

1. 渭南市檢驗檢測研究院（渭南 714000）；2. 富平縣檢驗檢測中心（渭南 711700）；3. 陜西省地質調查實驗中心（西安 710000）

氯霉素（Chloramphnicol，CAP）屬抑菌性廣譜抗生素，由委內瑞拉鏈絲菌產生，通過脂溶性可彌散進入細菌細胞內，抑制菌體蛋白合成，主要用于治療動物由傷寒桿菌、流感桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌等引起的感染[1]，特別是用于牛羊等動物乳腺炎的治療，從而易使奶及奶制品中存在氯霉素殘留[2]。甲砜霉素（Thiamphenicol，TAP）和氟甲砜霉素（氟苯尼考，Florfenicol，FF）與氯霉素同屬于一類化合物，它們的抗菌作用與氯霉素相似。CAP對人體有嚴重的副作用，它能抑制人體骨骼造血功能而引起再生障礙性貧血癥和粒狀白細胞缺乏癥等疾病，TAP不產生再生障礙性貧血，但抑制紅細胞、白細胞、血小板的生成[3]。我國農業部250號公告將CAP列為禁用藥[4]，TAP和FF在不同動物組織中限量不同，但沒有規定羊奶中限量[5]，標準GB 29688[6]和GB/T 22338[7]規定的三種組分的定量限為0.1 μg/kg。目前，關于動物食品中氯霉素類化合物的檢測方法已經很多，有氣相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、液相色譜-質譜聯用法、酶聯免疫法等多種方法[8-12]。對于羊奶與牛奶的組成和營養差異也有較多研究，且兩者的營養素構成和維生素、礦物質含量存在明顯的差異[13]，而在羊奶中氯霉素類藥物檢測方面，并沒有相關報道。所以建立一種羊奶中氯霉素類藥物的檢測方法對于日常風險監測及監管都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素標準物質（德國Dr. Ehrenstorfer公司）；氘代氯霉素（氯霉素-D5），溶于乙腈溶液，質量濃度為100 mg/L（上海安譜實驗科技有限公司）；乙酸乙酯（色譜純，阿拉丁試劑公司）；乙腈（色譜純，德國默克公司）；18.2 MΩ超純水（由賽多利斯超純水處理系統處理得到）；羊奶樣品（來源于渭南富平某奶站）。

Agilent 6460質譜儀配Agilent1290超高效液相色譜儀，ESI離子源（美國Agilent公司）；Agilent SBC18色譜柱（柱長150 mm，柱內徑2.1 mm，填料粒徑5 μm，美國Agilent公司）；MTN-5800A-24氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 液相洗脫條件和質譜條件的選擇

分離條件以GB/T 22338—2008[7]為基礎，依據儀器條件和色譜柱的不同進行調整，使3個組分能完全分離。

1.2.2 樣品制備方式的選擇

按照提取、凈化、濃縮的步驟制備試樣，以回收率考察方法的準確性。回收率的計算參考GB/T 27417—2017[14]中正確度的計算。

1.2.3 定量限的測定

在羊奶中添加目標化合物，做平行樣，測基線噪音值，依據特征離子色譜峰rSN＞10為方法定量限，測定方法的定量限。

2 結果與分析

2.1 液相洗脫條件和質譜條件優化

2.1.1 色譜條件

流速：0.8 mL/min；流動相A：水；流動性B：乙腈；梯度洗脫：0～2.0 min，90% A～70% A；2.0～5.5 min，70% A～25% A；5.5～6.0 min，25% A～0% A；6.0～7.0 min，0% A；7.0～10.0 min，0 A～90% A；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。

2.1.2 質譜條件

電離方式：ESI-；霧化器壓力：50 Psi；毛細管電壓：4 000 V；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：12L/min；多反應監測（MRM）模式。待測物的其他參數見表1。

表1 各組分串聯質譜分析參數

先后嘗試了甲醇和水的混合洗脫條件，結果因樣品和初始流動相的溶解關系，出現了肩峰，三個組分并不能完全分離，采用乙腈和水的流動相后，肩峰情況改善，優化洗脫梯度后，見2.1.1小節，三個組分有效分離，結果見圖1。

圖1 三種組分總離子流圖及定量MRM結果

2.2 凈化條件的優化

由于羊奶中含有大量的蛋白質以及非極性磷酯類干擾物，容易形成基質干擾，因此必須對其進行凈化處理，以達到減少基質效應的效果。凈化的方式主要有液液分配和SPE兩種方式[15]。研究分別比較了乙酸乙酯直接提取和LC-Si硅膠小柱的凈化方式。結果顯示，硅膠柱凈化的回收率較低，沒有液液分配直接提取的回收率高，因此，選擇乙酸乙酯直接提取的方式。

2.3 定溶液的優化

樣品提取液濃縮后，用25%乙腈、10%乙腈和10%甲醇分別溶解后上機測定，結果顯示10%甲醇有肩峰，可能是流動相和溶劑不相容，25%乙腈分離效果較差，最終選擇與初始流動相比例相同的10%乙腈溶解殘渣，進行上機測定。

2.4 樣品制備

稱取2 g（精確至0.001 g）羊奶樣品置于50 mL離心管中，加入20 mL乙酸乙酯，渦旋混合均勻，將乙酸乙酯層轉移至另一離心管中，殘渣中再次加入20 mL乙酸乙酯，渦旋混合均勻，合并兩次乙酸乙酯層，在40 ℃水浴中用氮吹儀吹干，準確加入1.0 mL 10%乙腈溶解殘渣，用0.22 μm有機濾膜過濾，供UPLC-MS/MS分析用。

2.5 內標量的優化

氯霉素的測定普遍采用氯霉素D5作為同位素內標。選定了內標化合物之后，確定合適的內標濃度對于檢測工作也是至關重要的[16]。內標濃度的選擇沒有統一標準，試驗過程中嘗試了兩種內標濃度，內標濃度較高時，加標回收率較低，內標濃度低時，氯霉素測定含量穩定，回收率較高。最后了內標濃度確定為10 ng。

2.6 線性范圍、線性方程和定量限

表2 三種組分的線性方程、相關系數和定量限

以峰面積（y）為縱坐標，標準品質量濃度（x）為橫坐標，進行線性回歸，建立回歸方程，各組分回歸方程如表所示。

按照定量限的測定方法，離子色譜峰rSN＞10，測定定量限。氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的定量限為0.089 7，0.092 5和0.083 6 μg/kg。

2.7 回收率和精密度

在空白樣品基質中添加3個水平（0.1，1.0和5.0 μg/kg）的標準品進行加標回收試驗，每個添加水平重復6次，結果見表3。結果表明，三個組分的回收率為88.8%～112.8%，相對標準偏差為0.2%～12.3%，方法的精密度和準確度能夠滿足定量分析要求。

表3 三種組分的加標回收率與精密度（n=6）

2.8 儀器重復性

將混合標準系列5重復進樣測定6次，計算變異系數（C.V.），結果見表4。

表4 儀器重復性試驗結果

2.9 樣品檢測結果

按照前述的液相色譜-質譜聯用方法對實際5份羊奶樣品進行檢測，結果均為未檢出。制備加標羊乳樣品進行分析，樣品中三種組分能夠完全分離，基本無干擾峰，且分析時間很短。說明該方法運用到實際樣品的檢測中可以得到較好的分離分析結果。樣品分析色譜圖見圖2。

圖2 羊奶樣品中三種組分總離子流圖

3 結論

研究采用乙酸乙酯沉淀蛋白、氮吹濃縮的方式建立了一種高效液相色譜-質譜聯用法同時測定羊奶中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留量的方法。該方法簡化了樣品前處理步驟，避免了凈化柱的使用，簡單、快速、靈敏度高、準確性強。另外，降低了成本，對長期從事食品檢測的試驗人員來說，減少了試驗過程中有機試劑對身體的危害，具有重要意義。