QuEChERS-UPLC-MS/MS法快速測定蘋果中304種農藥殘留

何成軍，成長玉，鐘慈平，姚歡，杜鋼，余曉琴

四川省食品檢驗研究院（成都 611731）

蘋果是我國最重要的落葉果樹之一。據國家統計局公布的數據，2021年我國蘋果總產量達4 597.34萬 t。蘋果營養價值高、熱量低，富含多種礦物質和維生素，是人們經常食用的水果之一。蘋果在種植過程中容易遭受多種病蟲害[1-5]。截至2019年10月，國內蘋果共登記6 012種農藥，其中現行有效產品2 463種[6]，登記量總體處于較高水平。部分果農為控制病害、增加產量而出現多種農藥濫用、亂用的情況屢有發生，從而導致農殘超標，危害消費者健康。因此，建立一種通用、快速、高效的多種農藥殘留快速篩查的檢測方法具有十分重要的現實意義。

農藥殘留檢測方法主要有氣相色譜法[7]、高效液相色譜法[8]、氣相色譜-串聯質譜法[9-11]、超高效液相色譜-串聯質譜法[12-14]和飛行時間質譜[15-17]，由于超高效液相色譜-串聯質譜法具有高效、快速、靈敏、高選擇性和高通量等優點，該方法是國內外農藥殘留檢測最主要的檢測方法之一[18-20]。QuEChERS方法具有簡便、快捷、經濟、高效、安全等優點，自發布以來，獲得美國分析化學家協會、歐盟等多個國際機構認可，被廣泛應用于食品中農藥殘留分析[21]。

選擇QuEChERS提取和凈化作為前處理，結合靈敏度高、抗干擾能力強且普及率高的超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜儀，對蘋果中多種農藥殘留進行快速篩查和確證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

蘋果樣品購于本地市場；304種農藥混合標準品（質量濃度均為10 μg/mL，阿爾塔科技有限公司）；乙腈、甲醇（色譜純，美國Thermo Fisher公司）；甲酸、甲酸銨（色譜純，天津市科密歐化學試劑公司）；試驗用水為超純水。

Agilent 1260 Infinity II超高效液相色譜儀、Agilent 6470三重四極桿質譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）（美國Agilent公司）；Heraeus Multifuge X3R高速冷凍臺式離心機、Barnstead Gen Pure超純水機（美國Thermo Fisher公司）；XSE 105分析天平（瑞士Mettler公司）；N1全自動氮吹濃縮儀（上海屹堯儀器科技發展有限公司）。

1.2 樣品前處理

精密稱取10 g經粉碎的樣品，置于50 mL離心管中，加入一顆陶瓷均質子，再精密加入10 mL乙腈，加入QuEChERS提取包，振蕩提取2 min后按6 000 r/min離心5 min，將上清液轉移至另一離心管中，殘渣加入10 mL乙腈重復提取1次，將2次提取液合并。準確移取6 mL提取液至15 mL具塞離心管中，加入QuEChERS凈化包，渦旋1 min，按6 000 r/min離心5 min后，精密吸取5 mL上清液于40 ℃氮吹至近干，加入1 mL乙腈渦旋溶解，經0.22 μm濾膜過濾，待超高效液相色譜-質譜聯用儀分析。

1.3 超高效液相色譜-質譜條件

1.3.1 液相色譜條件

色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse C18（150 mm×4.6 mm，1.8 μm）色譜柱；流動相A為5 mmol/L甲酸銨含0.1%甲酸水溶液，流動相B為含0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫程序：0～0.5 min，90% A；0.5～3.0 min，90%～50% A；3.0～20.0 min，50%～0% A；20.0～24.0min，0% A；24.0～24.1 min，0.0%～90% A；24.1～27.0 min，90% A；流速0.40 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2.0 μL。

1.3.2 質譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI）；負離子（ESI-）與正離子（ESI+）模式同時采集；檢測方式為動態多反應檢測（DMRM）；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流量5 L/min；鞘氣溫度250 ℃；鞘氣流量11 L/min；毛細管電壓3 500 V；各農藥化合物的質譜MRM圖見圖1。

圖1 有機溶劑中304種農藥混合標準溶液（500 ng/mL）的MRM色譜圖

1.4 標準溶液的配制及標準曲線

1.4.1 農藥混合標準儲備液

分別取適量混合農藥標準品，置于同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度。制成1 000 ng/mL的標準品儲備溶液，置于-18 ℃冰箱避光儲存。

1.4.2 基質匹配混合標準工作溶液

取蘋果空白樣品，按照1.2小節的處理方法制得空白基質溶液，加入適量上述混合標準溶液，稀釋成10，50，100，200和500 ng/mL的系列基質匹配混合農藥標準工作溶液，上機測定，繪制標準工作曲線，現用現配。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

由于304種化合物的結構差異較大，因此選擇性能優異、穩定性好、載樣量高和分離度優異的Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18超高效液相色譜柱。并且考察長度100 mm和150 mm的色譜柱的分離效果。結果顯示，304種農藥化合物在Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，1.8 μm）上以較為理想的保留時間得到理想的分離效果。

2.2 質譜條件的選擇

從304種農藥化合物的結構可以看出，其中的大部分化合物會進行電噴霧正離子模式電離，一小部分進行電噴霧負離子模式電離。質譜數據顯示，304種農藥中有4種化合物（除蟲脲、氟蟲腈、氟苯脲、氟蟲脲）采用負離子模式進行掃描，另外300種化合物采用正離子模式進行掃描。由于快速篩查方法需要在較短時間內盡可能多地檢測化合物，所以采用正、負離子同時進行采集的模式較為適用。同時，在確定各化合物保留時間的基礎上，質譜采用動態多反應模式監測，在化合物保留時間±30 s內掃描，提高了各化合物的靈敏度和定性準確性。

2.3 質譜數據庫的建立與優化

配制304種農藥的混合標準溶液（500 ng/mL），采用儀器自動進樣方式，優化每種農藥質譜參數，獲得最佳的碎裂電壓和碰撞能量，確定每個化合物的保留時間，選取2組靈敏度最佳的離子對進行檢測，一組用來定量，另一組輔助定性。為了兼顧各化物不同的電離方式，采用正、負離子同時掃描模式進行檢測，建立農藥化合物的MRM數據庫，部分數據見表1。

表1 118種農藥的保留時間和定性、定量離子對、碰撞電壓、裂碎電壓、相關系數、回收率和精密度

接表1

接表1

2.4 樣品前處理方法的選擇

對于多種化合物的通用快速前處理方法選擇，既要考慮大部分化合物的回收率，又要兼顧樣品基質的凈化，減少雜質的影響。以乙腈作為提取溶劑，既可以有效地提取樣品中的目標化合物，也能使樣品中的蛋白質變性沉淀，可以減少蛋白質對樣品分析的干擾。無水硫酸鎂能除去樣品溶液中的水分，PSA能去除樣品溶液中的小部分色素和大部分有機酸和糖類，GCB能吸附樣品溶液中的大部分色素雜質。結果表明，使用QuEChERS提取包（含4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g二水合檸檬酸三鈉和0.5 g半水檸檬酸氫二鈉）和QuEChERS凈化包（含150 mg PSA、15 mg GCB和885 mg MgSO4），對蘋果樣品溶液進行提取和凈化，各化合物色譜峰無干擾峰，回收率為73.7%～115.9%，能夠滿足快速篩查的前處理要求。

2.5 線性范圍和定量限

稱取6份空白蘋果樣品，按1.2小節的樣品前處理方法處理得到空白基質溶液，并配制質量濃度分別為10，50，100，200和500 ng/mL的基質匹配標準工作溶液。在已經優化的色譜和質譜條件下測定，以質量濃度（x，ng/mL）為橫坐標，各農藥化合物的峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線。結果顯示，304種農藥在10～500 ng/mL范圍內均呈現出良好的線性關系，相關系數均在0.995以上。

2.6 回收率與精密度

向空白蘋果樣品中準確加入適量304種農藥標準品儲備溶液，制備3個添加水平（10，40和80 μg/kg）的加標回收樣品，每個水平制備6個平行樣（n=6）。按照1.2小節的處理方法，按照1.3小節的方法分析，基質匹配外標法定量，計算加標回收率和相對標準偏差。結果表明，304種農藥化合物的平均回收率為73.7%～115.9%，相對標準偏差為0.5%～17.9%（n=6）。

2.7 方法的驗證與結果

2020年中國檢疫科學研究院組織了高通量非靶向農藥殘留篩查能力評價，評價包括定性篩查和準確定量兩個方面的內容。將此次建立的快速篩查方法測定能力驗證提供的蘋果樣品，對樣品中的未知農藥進行定性篩查和準確定量，評估該方法的定性可靠性和定量準確性。

定性篩查要求在組織方提供的農藥化合物清單中篩查出所添加的農藥化合物種類，并且要求對所篩出的農藥化合物進行準確定量。應用該方法從能力驗證樣品中篩查出12種農藥（定量結果見表2），并采用相應的標準品進行進一步的準確定量。結果表明，建立的方法對蘋果中農藥殘留的定性能力強，與組織方公布的農藥種類完全一致，而且定量結果準確可靠，所有篩查出的化合物的定量結果z值均小于2，結果為滿意。

表2 蘋果中高通量非靶向農藥殘留篩查能力驗證結果

3 結論與討論

此次試驗將QuEChERS前處理技術與超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜相結合，對蘋果中的多種農藥進行定性篩查和定量分析；建立了蘋果中304種農藥的質譜數據庫，用于多種農藥殘留的快速篩查和確證。將所建立的方法應用于2020年中國檢疫科學研究院組織的高通量非靶向農藥殘留篩查能力評價，定性和定量結果均為滿意。該方法具有簡單、快速、高效、準確的特點，在較短時間內即可完成樣品的前處理及上機測定，實現對蘋果樣品中304種農藥殘留的快速篩查和準確定量。

另外，該方法中有118種農藥化合物（質譜參數見表1，占本方法化合物的38.8%）在2021年9月3日實施的GB 23200.121—2021《食品安全國家標準 植物源性食品中331種農藥及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質譜聯用法》中沒有涵蓋。這些化合物的正確度和精密度均符合農業部2386號公告[22]中的相關要求，且該方法的前處理與該標準中蔬菜、水果等樣品的前處理方法基本一致，可以考慮將該方法所提供的質譜參數等相關信息應用于國家標準的進一步提升，以期為食品安全監管應急檢驗提供有力的技術支撐。