液質(zhì)聯(lián)用法測定牛乳中阿苯達(dá)唑殘留標(biāo)志物殘留量

朱建新

上海德諾產(chǎn)品檢測有限公司（上海 200436）

阿苯達(dá)唑是一種咪唑衍生物類廣譜驅(qū)腸蟲藥物，因其治療效果好、毒性小等優(yōu)勢，被廣泛用于治療動(dòng)物的腸道寄生蟲感染病[1-2]。阿苯達(dá)唑進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后會(huì)代謝為阿苯達(dá)唑亞砜，阿苯達(dá)唑砜和阿苯達(dá)唑-2-氨基砜[3-4]。在體內(nèi)代謝為亞砜類或砜類后，抑制寄生蟲對葡萄糖的吸收，導(dǎo)致蟲體糖原耗竭，或抑制延胡索酸還原酶系統(tǒng)，阻礙ATP的產(chǎn)生，使寄生蟲無法存活和繁殖，是獸醫(yī)臨床使用最廣泛的藥物之一[5-7]。

近年來，阿苯達(dá)唑也應(yīng)用到奶牛的規(guī)模化養(yǎng)殖中，雖然其毒性較低，但母畜長時(shí)間使用會(huì)對胎兒有致畸作用和胚胎毒性[8]。而且該藥物可能在奶牛體內(nèi)經(jīng)代謝后殘留在鮮奶中，會(huì)對人類的健康產(chǎn)生一定危害[9-10]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和國際食品法典委員會(huì)都對牛奶中的限量進(jìn)行規(guī)定，要求不得超過100 μg/kg[11]。殘留標(biāo)志物為阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜和阿苯達(dá)唑之和，現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)中尚沒有同時(shí)測定牛奶中阿苯達(dá)唑及其殘留物的方法，試驗(yàn)旨在建立一種可一次性完成阿苯達(dá)唑及其殘留標(biāo)志物檢測的方法，并保證操作便捷。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈（CH3CN）、甲酸（HCOOH）（默克公司）、乙酸（CH3COOH）（國藥集團(tuán)）（色譜純）；超純水（H2O）（電阻率18.2 MΩ·cm）；PCX凈化柱（艾杰爾公司）；阿苯達(dá)唑亞砜99.0%±0.5%、阿苯達(dá)唑砜98.6%±0.5%、阿苯達(dá)唑99.0%±1.0%（Dr.Ehrenstorfer）；阿苯達(dá)唑氨基砜＞99.8%（WITEGA）。

1.2 儀器與設(shè)備

5500+QTRAP液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（AB Sciex）；VM-T1渦旋混勻器（上海泰坦科技股份有限公司）；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKA）；Sorvall ST16R高速冷凍離心機(jī)（thermosorvall & fiberlite）；AL204電子天平（METTLER TOLEDO）；2300TH超聲波清洗器（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件的確定

1.3.1.1 色譜柱的選擇

色譜條件：色譜柱Water BEH C18柱（50 mm×2.

1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI源）；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子化電壓5500 V；離子源溫度550 ℃；氣簾氣（psi）30.0；噴霧氣GS1（psi）55.0；輔助加熱氣GS2（psi）55.0；阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜定性離子分別為190.9，208.0，159.2和133.2；定量離子分別為234.0，240.0，266.2和198.2。

流動(dòng)相的考察。流動(dòng)相A分別為0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸+10 mmol/L；流動(dòng)相B為乙腈，加入乙酸銨阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其他條件不變，上機(jī)測定，測得的響應(yīng)值詳見表1。綜合4種殘留物考慮，流動(dòng)相A采用0.1%甲酸水溶液，其響應(yīng)值最大，故選擇之。

表1 阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜的響應(yīng)值

1.3.1.2 前處理方法的選擇

1.3.1.2.1 提取液考察

準(zhǔn)確稱取牛奶樣品2.00 g，加入阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜混合標(biāo)準(zhǔn)溶液6.0 ng/mL，分別經(jīng)甲酸+乙腈、乙酸+乙腈和檸檬酸+乙腈提取，過柱，吹干，0.1%甲酸水溶解，過膜，上機(jī)測定，測得阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜的濃度詳見表2，綜合考慮，采用乙酸+乙腈提取效果最好，故采用之。

表2 阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜質(zhì)量濃度

1.3.1.2.2 凈化柱考察

準(zhǔn)確稱取牛奶樣品2.00 g，加入阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 ng/mL，經(jīng)乙酸、乙腈提取，分別過C18柱、PCX柱和HLB柱，吹干，0.1%甲酸水溶解，過膜，上機(jī)測定，測得阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜的濃度詳見表3，綜合考慮，過PCX柱效果最好，故采用之。

表3 阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜的質(zhì)量濃度

2 結(jié)果與分析

2.1 線性與范圍

在優(yōu)化條件下，對質(zhì)量濃度分別為2.0，5.0，10，20，50和200 ng/mL的阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜標(biāo)液進(jìn)行分析，以質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)X，以相應(yīng)峰面積（Y）為縱坐標(biāo)Y，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)詳見表4。

表4 阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.2 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

稱取牛奶樣本，進(jìn)行2.0，6.0和20 μg/kg這3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)（n=6），阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜回收率在82.5%～112.5%，SRSD范圍為0.49%～2.02%，結(jié)果詳見表5。

表5 阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

為測試試驗(yàn)方法的重現(xiàn)性，選取1份有牛奶樣本，每天對其進(jìn)行加標(biāo)測定8次（加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2 μg/kg），連續(xù)測定3 d，考察方法的日內(nèi)精密度（n=8）和日間精密度（n=3）試驗(yàn)，結(jié)果表明，日內(nèi)精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差SRSD為1.72%，日間精密度的SRSD為2.15%。

2.4 檢出限試驗(yàn)

空白樣品（牛奶）中添加50 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜溶液20 μL于2 g空白樣品（即加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5 μg/kg），使用優(yōu)化后的樣品處理方法和流動(dòng)相，上機(jī)測定，測得阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜的信噪比S/N均≥3，檢測結(jié)果詳見表6，即檢出限可降低至0.5 μg/kg，定量限可至2.0 μg/kg，該方法具有較高的靈敏度。

表6 阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜信噪比

3 結(jié)論

綜上所述，采用0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，用乙酸+乙腈提取，經(jīng)PCX柱凈化，從線性與范圍、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、檢出限等方面進(jìn)行了考察，結(jié)果表明該方法簡便易行，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，檢出限低至0.5 μg/kg，可用于牛乳中阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜殘留物的測定，為牛乳中阿苯達(dá)唑殘留標(biāo)志物殘留量的控制提供方便可行的技術(shù)手段。