液質聯用法測定牛乳中阿苯達唑殘留標志物殘留量

朱建新

上海德諾產品檢測有限公司（上海 200436）

阿苯達唑是一種咪唑衍生物類廣譜驅腸蟲藥物，因其治療效果好、毒性小等優勢，被廣泛用于治療動物的腸道寄生蟲感染病[1-2]。阿苯達唑進入動物體內后會代謝為阿苯達唑亞砜，阿苯達唑砜和阿苯達唑-2-氨基砜[3-4]。在體內代謝為亞砜類或砜類后，抑制寄生蟲對葡萄糖的吸收，導致蟲體糖原耗竭，或抑制延胡索酸還原酶系統，阻礙ATP的產生，使寄生蟲無法存活和繁殖，是獸醫臨床使用最廣泛的藥物之一[5-7]。

近年來，阿苯達唑也應用到奶牛的規模化養殖中，雖然其毒性較低，但母畜長時間使用會對胎兒有致畸作用和胚胎毒性[8]。而且該藥物可能在奶牛體內經代謝后殘留在鮮奶中，會對人類的健康產生一定危害[9-10]。我國農業農村部和國際食品法典委員會都對牛奶中的限量進行規定，要求不得超過100 μg/kg[11]。殘留標志物為阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜和阿苯達唑之和，現行國家標準和文獻中尚沒有同時測定牛奶中阿苯達唑及其殘留物的方法，試驗旨在建立一種可一次性完成阿苯達唑及其殘留標志物檢測的方法，并保證操作便捷。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈（CH3CN）、甲酸（HCOOH）（默克公司）、乙酸（CH3COOH）（國藥集團）（色譜純）；超純水（H2O）（電阻率18.2 MΩ·cm）；PCX凈化柱（艾杰爾公司）；阿苯達唑亞砜99.0%±0.5%、阿苯達唑砜98.6%±0.5%、阿苯達唑99.0%±1.0%（Dr.Ehrenstorfer）；阿苯達唑氨基砜＞99.8%（WITEGA）。

1.2 儀器與設備

5500+QTRAP液相色譜-串聯質譜儀（AB Sciex）；VM-T1渦旋混勻器（上海泰坦科技股份有限公司）；RV10旋轉蒸發儀（IKA）；Sorvall ST16R高速冷凍離心機（thermosorvall & fiberlite）；AL204電子天平（METTLER TOLEDO）；2300TH超聲波清洗器（上海安譜科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件的確定

1.3.1.1 色譜柱的選擇

色譜條件：色譜柱Water BEH C18柱（50 mm×2.

1 mm，1.7 μm）；流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量2 μL。

質譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI源）；檢測方式為多反應監測（MRM）；離子化電壓5500 V；離子源溫度550 ℃；氣簾氣（psi）30.0；噴霧氣GS1（psi）55.0；輔助加熱氣GS2（psi）55.0；阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜定性離子分別為190.9，208.0，159.2和133.2；定量離子分別為234.0，240.0，266.2和198.2。

流動相的考察。流動相A分別為0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸+10 mmol/L；流動相B為乙腈，加入乙酸銨阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜混合標準溶液，其他條件不變，上機測定，測得的響應值詳見表1。綜合4種殘留物考慮，流動相A采用0.1%甲酸水溶液，其響應值最大，故選擇之。

表1 阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜的響應值

1.3.1.2 前處理方法的選擇

1.3.1.2.1 提取液考察

準確稱取牛奶樣品2.00 g，加入阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜混合標準溶液6.0 ng/mL，分別經甲酸+乙腈、乙酸+乙腈和檸檬酸+乙腈提取，過柱，吹干，0.1%甲酸水溶解，過膜，上機測定，測得阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜的濃度詳見表2，綜合考慮，采用乙酸+乙腈提取效果最好，故采用之。

表2 阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜質量濃度

1.3.1.2.2 凈化柱考察

準確稱取牛奶樣品2.00 g，加入阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜混合標準溶液5.0 ng/mL，經乙酸、乙腈提取，分別過C18柱、PCX柱和HLB柱，吹干，0.1%甲酸水溶解，過膜，上機測定，測得阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜的濃度詳見表3，綜合考慮，過PCX柱效果最好，故采用之。

表3 阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜的質量濃度

2 結果與分析

2.1 線性與范圍

在優化條件下，對質量濃度分別為2.0，5.0，10，20，50和200 ng/mL的阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜標液進行分析，以質量濃度（μg/mL）為橫坐標X，以相應峰面積（Y）為縱坐標Y，建立標準曲線，得到的線性回歸方程和相關系數詳見表4。

表4 阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜線性方程及相關系數

2.2 準確度試驗

稱取牛奶樣本，進行2.0，6.0和20 μg/kg這3個水平的加標回收試驗（n=6），阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜回收率在82.5%～112.5%，SRSD范圍為0.49%～2.02%，結果詳見表5。

表5 阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜加標回收試驗結果

2.3 重復性試驗

為測試試驗方法的重現性，選取1份有牛奶樣本，每天對其進行加標測定8次（加標質量分數2 μg/kg），連續測定3 d，考察方法的日內精密度（n=8）和日間精密度（n=3）試驗，結果表明，日內精密度的相對標準偏差SRSD為1.72%，日間精密度的SRSD為2.15%。

2.4 檢出限試驗

空白樣品（牛奶）中添加50 ng/mL標準阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜溶液20 μL于2 g空白樣品（即加標質量分數0.5 μg/kg），使用優化后的樣品處理方法和流動相，上機測定，測得阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜的信噪比S/N均≥3，檢測結果詳見表6，即檢出限可降低至0.5 μg/kg，定量限可至2.0 μg/kg，該方法具有較高的靈敏度。

表6 阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜信噪比

3 結論

綜上所述，采用0.1%甲酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B，用乙酸+乙腈提取，經PCX柱凈化，從線性與范圍、準確度、重復性、檢出限等方面進行了考察，結果表明該方法簡便易行，測定結果準確可靠，靈敏度高，檢出限低至0.5 μg/kg，可用于牛乳中阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜殘留物的測定，為牛乳中阿苯達唑殘留標志物殘留量的控制提供方便可行的技術手段。