液相色譜串聯質譜法同時測定豆類芽苗菜中6種農藥殘留量

溫韜，寧方堯

1. 廣西壯族自治區產品質量檢驗研究院（南寧 530000）；2. 廣西工業職業技術學院（南寧 530000）

豆類芽苗菜中的黃豆芽和綠豆芽是老百姓餐桌上常見的美食[1-2]，隨著水生、土生栽培技術的發展，豆類芽苗菜充足，滿足消費者日常生活的需求，但一些不法商販為提高豆類芽苗菜的質量和產率，人為添加一些抗病毒、植物生長調節劑等，如恩諾沙星、環丙沙星，可以起到殺菌的作用，4-氯苯氧乙酸鈉可以抑制豆類芽苗菜根部的發育等[3-6]。因此，加強對豆類芽苗菜中恩諾沙星、環丙沙星、多菌靈、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉和甲硝唑的監控，對于保障老百姓舌尖上的安全具有重要意義。

近年來，關于豆類芽苗菜中抗生素、植物生長調節劑的研究較少。徐慧等[7]對豆芽中4-氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤2種植物調節劑的測定方法開展研究；潘項捷等[8]對高效液相色譜-串聯質譜法測定豆芽中甲硝唑和羥基甲硝唑2種甲硝唑類藥物的分析方法開展研究。上述研究的對象均為豆芽，未涉及其他豆類芽苗菜，且研究目標較為單一，不能更好地控制豆類芽苗菜中的質量水平。試驗探究通過建立全自動QuEChERS樣品制備系統-UPLC-MS/MS法檢測豆類芽苗菜中恩諾沙星、環丙沙星、多菌靈、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉和甲硝唑殘留量的分析方法，旨在為豆類芽苗菜中農藥殘留量測定提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器與設備

AB Triple Quad? 4500型三重四極桿串聯質譜儀（美國AB公司）；島津LC-30 A型液相色譜儀（日本SHIMADZU公司）；熱電ASE 300型加速溶劑提取儀（熱電）；梅特勒XS 205型萬分之一電子天平（瑞士mettler-toled公司）；Millipore Milli-q academic型超純水儀（美國mill-pore公司）；MTN-5800型自動水浴濃縮儀（天津奧特賽恩斯公司）。

1.2 試驗材料與試劑

恩諾沙星標準溶液（BW1355，質量濃度100 μg/mL）、環丙沙星標準溶液（BW1356，質量濃度100 μg/mL）、多菌靈標準溶液（標物編號BW02546，質量濃度100 μg/mL）、6-芐基腺嘌呤標準溶液（SB05-368-2016，質量濃度100 μg/mL）、4-氯苯氧乙酸鈉標準溶液（BW1348，質量濃度100 μg/mL）、甲硝唑標準溶液[GBW（E）090757，質量濃度100 μg/mL]，均為北京萬佳首化生物科技有限公司。甲醇、乙腈（均為色譜純，美國FLUKA公司）；甲酸、乙酸銨（均為分析純，阿拉丁公司）；其他試劑（均為分析純，國藥集團上?；瘜W試劑廠）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

分離柱為Waters Acquity BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.0 μm）；色譜柱溫度30 ℃；進樣量10 μL；流速0.25 mL/min；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水溶液。洗脫程序：0～2 min 10%～15% A，2～4 min 20%～36% A，4～6 min 36%～55% A，6～8 min 55%～91% A，8～10 min 91% A，10～10.1 min 91%～10% A。

1.3.2 質譜參數

開啟質譜儀，過夜抽真空（不少于12 h），調諧液調諧，調諧完畢后，設定質譜參數，質譜參數見表1。

表1 質譜參數

1.4 溶液配制

1.4.1 單標儲備溶液

分別取恩諾沙星、環丙沙星、多菌靈、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉和甲硝唑標準溶液，分別準確移取1.0 mL，置6個棕色量瓶中，加甲醇定容、搖勻，制得恩諾沙星、環丙沙星、多菌靈、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉和甲硝唑質量濃度均為10 μg/mL的單標儲備溶液。

1.4.2 標準曲線系列溶液

取上述6種待測物單標儲備溶液，分別準確移取適量，置棕色量瓶中，制備含恩諾沙星、環丙沙星、多菌靈、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉和甲硝唑質量濃度分別為0.01，0.05，0.10，0.50，1.00，5.00和10.00 μg/mL的標準曲線溶液，加甲醇定容、搖勻。

1.4.3 樣品溶液

取豆類芽苗菜樣品，粉碎機粉碎后，置自封袋中，冷凍儲存。準確稱取10.0 g樣品，置于整合管外管，依次加入20粒二氧化皓瓷珠包和10 mL甲醇-乙腈溶液（1∶2，V/V），提取試劑包混勻；將裝有凈化劑的內管置于整合管中，將整合管放入SiO-6512自動樣品制備系統主機中，運行。運行方法：以1 200 r/min振蕩15 min；以5 000 r/min離心10 min；以1 200 r/min振蕩15 min；以5 000 r/min離心10 min。程序結束后取出整合管，準確吸取2.0 mL上清液，置氮吹儀氮吹至近干，加1.0 mL甲醇渦旋混合1 min，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2 結果與討論

2.1 提取方法的選擇

豆類芽苗菜含有大量的碳水化合物、微量元素、蛋白質等成分，因此選擇合適的提取方法對提高待測物的檢測準確度和提取效率有較大影響?？股丶稗r藥殘留常用的提取方法有超聲提取法、振蕩提取法、加速溶劑提取法和QuEChERS提取法。其中：超聲提取法和振蕩提取法操作繁瑣，提取時間較長，且提取率偏低，尤其對地表水中極微量除草劑殘留不適用；加速溶劑提取法，針對土壤樣品提取率較高，對于豆類芽苗菜適用性較差，且試劑用量大，環境友好度偏低；QuEChERS提取法是近年來使用較多的提取方法，自動QuEChERS提取法和手動QuEChERS提取法相比較，節省了人力，提高了提取效率。試驗分別選用上述4種方法，對加標質量濃度0.1 μg/mL的加標樣品進行提取，自動QuEChERS提取法具有最佳的回收率，比較結果見表2。

表2 提取方法比較結果

2.2 提取溶劑的選擇

恩諾沙星、環丙沙星、多菌靈、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉和甲硝唑這6種待測物極性較弱，因此選擇適合的提取溶劑可以有效地提高提取率，提高檢測準確度。恩諾沙星、環丙沙星、甲硝唑常用的提取溶劑為甲醇；多菌靈、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉常用的提取溶劑為乙腈。因此試驗分別選擇甲醇、乙腈、甲醇-乙腈溶液（1∶2，V/V）作為提取溶劑，保持1.4.3小節的樣品溶液制備方法其他條件不變，對加標質量濃度0.1 μg/mL的加標樣品進行提取。結果表明，甲醇-乙腈溶液（1∶2，V/V）時，恩諾沙星、環丙沙星、多菌靈、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉和甲硝唑回收率最佳，比較結果見表3。

表3 提取溶劑比較結果

2.3 質譜多反應監測（MRM）方法的建立

取1.4.1小節的10 μg/mL的恩諾沙星單標儲備溶液，加甲醇-乙腈溶液（1∶2，V/V）配制每1 mL溶液中含有恩諾沙星100 ng的測試溶液，質譜掃描模式設定為全掃描模式（Q1 Scan），進樣恩諾沙星測試溶液，得到恩諾沙星母離子質量數；質譜掃描模式設定為產物離子掃描模式（product scan），得到恩諾沙星母離子對應的碎片離子；根據碎片離子的豐度，選擇豐度較高的2個產物離子，一個作為定量離子，另一個作為定性離子，根據選擇的離子對分別進行去簇電壓（DP）和碰撞動能（CE）的優化，建立恩諾沙星多反應監測方法。同法建立環丙沙星、多菌靈、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉和甲硝唑的多反應監測方法，多反應監測方法見表4。

表4 多反應監測方法列表

2.4 曲線方程、范圍和檢測限

取1.4.1小節的待測物單標儲備溶液，分別準確移取適量，置棕色量瓶中，制備含恩諾沙星、環丙沙星、多菌靈、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉和甲硝唑質量濃度分別為0.01，0.05，0.10，0.50，1.00，5.00和10.00 μg/mL的曲線溶液，加甲醇定容、搖勻；按1.3.1小節和1.3.2小節設定儀器，基線穩定后分別進樣上述曲線溶液，以待測物質量濃度為橫坐標（X，μg/mL），定量離子的峰面積作為縱坐標（Y）建立標準曲線，以待測物響應為3倍信噪比（rSN）作為檢測限。結果見表5，典型譜圖見圖1。

圖1 典型譜圖

表5 曲線方程、范圍及檢測限

2.5 加標回收率考察

取不含上述6種待測物的豆類芽苗菜樣品，粉碎機粉碎后，置自封袋中，準確稱取10.0 g樣品，置于整合管外管，分別定量加入適量1.4.1小節的待測物單標儲備溶液，按1.4.3小節的方法進行處理，制備含恩諾沙星、環丙沙星、多菌靈、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉和甲硝唑最終質量濃度依次為5，250和1 000 μg/kg的加標測試溶液，按1.3.1小節和1.3.2小節設定儀器，基線穩定后分別進樣上述加標測試溶液，根據實際檢測結果和加入量計算加標回收率，結果見表6。

表6 加標回收率結果

2.6 方法重復性考察

取不含上述6種待測物的豆類芽苗菜樣品，粉碎機粉碎后，置自封袋中，準確稱取10.0 g樣品，置于整合管外管，平行稱取6份樣品；分別定量加入適量1.4.1小節的待測物單標儲備溶液，按1.4.3小節的方法進行處理，制備含6種帶儲物最終質量濃度0.1 μg/mL的重復性測試溶液，按1.3.1小節和1.3.2小節設定儀器，基線穩定后分別進樣上述測試溶液，根據檢測結果計算重復性SRSD，結果見表7。

表7 重復性測試結果

3 結論

試驗建立采用全自動QuEChERS樣品制備系統提取豆類芽苗菜中恩諾沙星、環丙沙星、多菌靈、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉和甲硝唑6種化合物，超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜法定性、定量檢測的分析方法。試驗方法與其他前處理方法比較，提取率較高，檢測準確度較好，并考察方法的線性、重復性、檢測限等項目。結果表明，試驗方法自動化水平、提取效率高，檢測準確度好，適用于豆類芽苗菜中非法使用化合物的監測。