侵染小構樹的雙生病毒及其缺陷DNA形式的檢測和特征分析

孔衛青，楊金宏，凌君，楚渠，孟剛

(安康學院陜西省蠶桑重點實驗室，陜西 安康 725000)

雙生病毒是世界范圍內具有嚴重危害的單鏈環狀DNA病毒，可以侵染多種經濟作物，通常以葉蟬、粉虱、蚜蟲、角蟬等昆蟲為介體進行傳播[1]。雙生病毒基因組結構有單組分和雙組分兩種。單組分結構雙生病毒的基因組由一個環狀單鏈DNA(single-stranded DNA，ssDNA)組成，可編碼4～7個開放閱讀框，其中病毒鏈主要編碼外殼蛋白(coat protein，CP)和移動蛋白(movement protein，MP)，互補鏈上主要編碼復制相關蛋白(replication-related protein A，RepA)及其剪接體Rep。病毒鏈和互補鏈的ORF之間由大小間隔區(large/small intergenic region，LIR/SIR)隔開[1]。雙組分雙生病毒的基因組由兩個環狀ssDNA(DNA-A和DNA-B)組成，僅存在于菜豆金黃花葉病毒屬(Begomovirus)[2]，其中DNA-A組分的病毒鏈主要編碼CP蛋白、互補鏈編碼Rep，DNA-B組分主要編碼MP蛋白，具有雙生病毒復制和轉錄需要的莖環結構及保守的頂端序列。另外，雙生病毒還往往存在伴隨分子，如缺陷DNA(defective DNA，D-DNA)，其由雙組分雙生病毒的DNA-B組分或單組分雙生病毒的DNA-A缺失引起，有部分Rep基因和完整的IR區，有些含未知來源序列的插入甚至新的ORF[3]。D-DNA可以影響輔助病毒的正常活動，進而使病毒病癥狀減輕，因此可以此發展新的抗病策略[4]。

小構樹(Broussonetia kazinoki)是薔薇目桑科構屬植物，木質素含量低，是優質的造紙原料。小構樹還可做藥用，果實及根皮有補腎利尿、強筋骨的功效，韌皮部汁液可治癬瘡及蛇蟲獸等的咬傷。由小構樹作母本培育得到的雜交構樹，葉片肥厚，蛋白含量高，能代替奶牛精飼料生產使用的苜蓿草。近年來，在秦嶺腹地發現較多的小構樹出現葉片黃化現象。據Qiu等[5]的研究表明，構樹卷葉病毒(Paper mulberry leaf curl virus 1and2，PMLCV-1和PMLCV-2)可引起構樹葉片卷縮，但引起小構樹葉片黃化卷曲的病原未見報道。基于此本研究對小構樹的黃化卷曲葉片進行轉錄組測序分析，對其中的病毒及D-DNA形式進行鑒定分析，為今后該病毒的寄主及防治研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2021年6月至8月在陜西省安康市漢濱區建民鎮(JM)、恒口鎮(HK)、吉河鎮(JH)采集小構樹表現黃化卷曲癥狀葉片(Kozo)各2份，液氮速凍后-86℃保存備用。高保真Taq酶購自寶生物工程(大連)有限公司，其余試劑均為國產或進口分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 轉錄組測序及病毒序列分析 取3個地點的小構樹葉片各1份，采用植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取RNA，送生工生物工程(上海)有限公司進行文庫構建，并采用HiSeq2000平臺(美國ABI)進行轉錄組雙末端測序，測序長度150 bp。對測序所得數據進行質控處理，去除序列接頭、Q值＜20、長度小于35 bp的序列，得到的clean data用Trinity 2.8進行無參組裝，參數設置為min_kmer_cov 2，其余默認。將無參組裝獲得的所有序列進行在線BLASTx和BLASTn比對分析，利用HISTA 2.2軟件比對分析clean data中病原的基因組序列及覆蓋度。

1.2.2 PCR檢測和克隆測序鑒定 根據組裝獲得的病毒序列設計引物(表1)。利用植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取Kozo-JM、Kozo-HK、Kozo-JH樣本的基因組DNA，分別使用750F/2455R、3460F/1780R和2420F/3580R引物組合對3個樣本的基因組進行PCR擴增。擴增體系為:2×Premix 25 μL，上下游引物(20 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補齊至50 μL。擴增程序為:94℃5 min；94℃30 s，52℃45 s，72℃1 min，30個循環；72℃10 min。瓊脂糖凝膠回收試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]回收擴增目的條帶，連接至pGEMT easy載體(Promega公司)，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞[寶生物工程(大連)有限公司]，挑取3個陽性克隆送生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

表1 本研究使用引物及序列

1.2.3 序列分析 克隆子序列的拼接使用Bioedit 7.2.5，使用在線ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測編碼區，使用FGENESH 2.6[6]預測內含子，蛋白的保守功能域預測使用在線CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/)[7]和SMART(http://smart.embl.de/)，使 用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測跨膜結構域，使用MUSCLE 3.8.31[8]進行多序列比對。

1.2.4 D-DNA的擴增和分析 根據雙生病毒可能存在D-DNA的情況，對1.2.2中的非目標擴增條帶產物進行回收和克隆測序。同時再次提取Kozo-JM、Kozo-HK、Kozo-JH樣本各1份的基因組DNA，使用2420F引物分別和1780R以及3700R引物對各樣本進行PCR擴增，分別回收各擴增條帶，挑取3個克隆送生工生物工程(上海)有限公司進行測序，分析其中的D-DNA。

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序

Kozo-JM、Kozo-HB、Kozo-JH樣本的轉錄組測序數據經質控處理，分別獲得45 808 556、45 564 724、44 670 450條高質量序列，平均長度分別為140.69、137.70、138.81 bp；Trinity組裝所有序列獲得77 583條unigene；經BLASTx和BLASTn比對分析，得到一條與PMLCV-2同源的病毒序列，命名為小構樹卷葉病毒(Kozo leaf curl virus 2，KozoLCV-2)，未發現其它病原序列。

2.2 病毒序列的PCR擴增和克隆測序

使用設計合成的引物750F和2455R、3460F和1780R以及2420F和3580R對3個小構樹樣本中的病毒序列進行PCR擴增，結果750F和2455R引物對擴增出1 700 bp左右的單一條帶(圖1A)，3460F和1780R引物對除了擴增出約2 100 bp的主條帶，還在1 300 bp左右有一弱條帶(圖1B)，2420F和3580R引物對在JM和HK樣本中擴增出1 200 bp左右的單一條帶，JH樣本同時還獲得了500 bp左右的2條擴增條帶(圖1C)。

圖1 KozoLCV-2的PCR擴增

對擴增條帶1a、1b1和1c1進行回收克隆測序，拼接各序列獲得基因組序列，KozoLCV-2-JM和KozoLCV-2-HK長3 756 bp，KozoLCV-2-JH長3 758 bp(GenBank登錄號:OL514011～OL514013)，均為環狀結構，相互之間相似性在97.46%～99.65%，與PMLCV-2(MN595126～MN595128)序列相似性為88.82%～94.59%。

2.3 KozoLCV-2的D-DNA擴增和克隆測序

對2.2中PCR擴增的條帶1b2、1c2和1c3進行克隆測序，以分析其中是否存在D-DNA序列。結果分別獲得了1 270、610、582 bp序列，3條序列均發生了部分片段的缺失。

進一步使用2420F和1780R引物進行PCR擴增，結果3個樣本均在約1 200 bp和650 bp處分別有2條條帶(圖2A)；使用引物2420F和3700R進行PCR擴增，Kozo-JM和Kozo-HK樣本只有一條約150 bp條帶，而Kozo-JH樣本在約500 bp處還有兩條擴增條帶(圖2B)。

圖2 KozoLCV-2的D-DNAs的PCR擴增

對2a1、2a2、2b1、2b2、2b3擴增條帶進行克隆測序，2a1、2a2、2b1和2b2分別獲得1 196、635、549 bp和453 bp的序列，2b3的克隆子獲得了6條長度從128 bp到153 bp的序列。拼接組裝所有序列獲得10條長度1 257～3 114 bp的D-DNAs(GenBank登錄號:OL581701～OL581703，OL581710～OL581715，OL581717)。

2.4 序列分析

本研究獲得的KozoLCV-2基因組結構與PMLCV-2非常相似(圖3A)，正義鏈均含有4個ORF(V1、V2、V3和V4)，互補鏈2個(C1和C1:C2)；LIR位于C1和V3間，含有復制和轉錄所需的由高度保守的非核苷酸基序TAATATTAC及其兩側富含GC的反向重復序列形成的莖環結構(圖3B)；SIR位于V4和C1:C2間，也是正義鏈和互補鏈轉錄終止區。

進一步分析KozoLCV-2的編碼區，V1的ORF與V2部分重疊，其編碼的CP蛋白(E值4.41e-24)與PMLCV-2和柑橘褪綠矮縮相關病毒(Citrus chlorotic dwarf associated virus，CCDaV)的CP蛋白相似性分別為98%和73%。V2的ORF長321 bp，編碼106個氨基酸，N末端和中心區相對保守。V3區長216 bp，與V2部分重疊，編碼71個氨基酸，其中E13～V35為其跨膜結構域。V4區長909 bp，編碼302個氨基酸，在線CD預測其N11～S284區域與雙生病毒BL1移動蛋白有非常高的相似性(E值7.85e-107)。互補鏈上的兩個ORF(C1和C1:C2)分別編碼RepA和Rep，與PMLCV-2和CCDaV的同源蛋白相似性分別為90%和67%，含有雙生病毒Rep的相關結構域，如Motif I(F37LTYP41)、Motif II(H79VH81)、RCR motif III(Y131LKKS135)以及Walker A(G246PSRSGKT253)和Walker B(L279YNVIDDI286)等。

另外本研究KozoLCV-2的互補鏈上存在一個長119 bp的內含子(圖3C)，AU(61.34%)含量明顯高于兩側外顯子。利用轉錄組clean data分析其對基因組的覆蓋度，獲得了37條序列覆蓋兩外顯子間的連接處(圖3C)，表明其為選擇性剪接內含子，為體內同時產生編碼RepA和Rep的選擇性剪接提供了證據。

分析拼接所得10種D-DNAs形式，其中9種有完好的雙生病毒莖環結構，1種形式的該結構被來自PMLCV-2-TL的RepA第二外顯子的末端序列(2 531～2 636 bp)的插入破壞，該序列還同時插入了3種D-DNAs的SIR區。7種DDNAs形式有完整的ORF(V1～V4)，完全或部分缺失了復制酶區域，2種D-DNAs形式僅有ORF V4和V1部分(圖3D)，僅一種D-DNA有完整ORF V1和V4以及復制酶區域。

圖3 KozoLCV-2基因組結構特征及其D-DNAs的結構示意圖

3 討論與結論

小構樹廣泛分布于我國各省區，富含黃酮、生物堿和高蛋白，具有較大的經濟和藥用價值，迄今為止，未見有關小構樹病原體的研究。本研究應用轉錄組高通量測序獲得了小構樹黃化葉片中的雙生病毒序列，并通過不同覆蓋區域克隆子的測序，證實了小構樹的雙生病毒序列、環狀基因組結構及其D-DNAs形式。

與本研究KozoLCV-2具有序列相似性的病毒還有來自雙生病毒Citlodavirus屬的CCDaV[9]、PCMoV[10]、CaCDaV[11]，尤其V1(CP)和C1:C2(Rep)區。但KozoLCV-2的V2編碼的氨基酸僅與PMLCV-2的V2有高相似性，與CaCDaV的MP(QEQ92297.1)部分區域有50%的相似性。KozoLCV-2的V3編碼氨基酸，除PMLCV-2外，沒有其他匹配結果，類似的結果也存在于Euphorbia caput-medusae latent virus(EcmLV)[12]、Turnip curly top virus(TCTV)[13]、Eragrostis curvula streak virus(ECSV)[14]等雙生病毒中。KozoLCV-2的V4有典型的30 kD運動蛋白家族的特征，且序列上有dsDNA結合需要的Motif I、滾環復制中蛋白質構象和DNA斷裂的金屬結合位點域Motif II、DNA切割催化位點域motif III[15]以及核苷酸結合位點的重要成分Walker A和Walker B域[16]。

轉錄組數據中互補鏈的轉錄本為KozoLCV-2互補鏈含有內含子提供了證據，其具有植物U2型內含子(U2-type intron)的分支點特征和剪接位點[17]，AU接近高效拼接所需的最小值[18]，表明KozoLCV-2的Rep蛋白表達可能類似玉米條紋病毒Maize streak virus(MSV)[19]、Beet curly top Iran virus(BCTIV)[20]以及Grapevine red blotch-associated virus(GRBaV)[21]和EcmLV[12]等。

雙生病毒的D-DNA可以通過病毒基因組的缺失、倒置、重復、重排及外源DNA的插入形成，為病毒的重組提供了原始材料，豐富了雙生病毒種群多樣性[22]。D-DNA還能干擾輔助病毒的復制，如非洲木薯花葉病毒[African cassava mosaic virus(ACMV)]的DNA-B缺陷分子和勝紅薊黃脈病毒[Ageratum yellow mosaic virus(AYVV)]的DNA-A缺陷分子[4]，與輔助病毒的基因組DNA共同競爭寄主細胞資源，使病毒誘導的典型病癥減輕。由于缺陷DNA獨特的抗病毒作用，已被作為疫苗佐劑應用于動物病毒防治[23]。

本研究發現，雖然KozoLCV-2和PMLCV-2基因組結構和組成非常相似，但小構樹的KozoLCV-2基因組同時存在D-DNAs，而Qiu等[5]的研究以及本團隊檢測患病構樹中均沒有D-DNA分子(結果未展示，GenBank登錄號:OL514014～OL514016)，說明同種病毒的D-DNA的產生具有宿主差異性。