山東地方雞種NR3C2基因多態性檢測及其與繁殖性狀的關聯分析

周艷雷秋霞韓海霞李福偉劉杰劉瑋王杰湯存偉李大鵬曹頂國

(1.山東省農業科學院家禽研究所，山東 濟南 250100；2.山東省家禽育種工程技術研究中心，山東 濟南 250100；3.山東益嘉種禽有限公司，山東 臨沂 276000)

鹽皮質激素受體(MR，NR3C2)是核受體超家族的一員，該超家族是一類配體依賴性轉錄因子，在多細胞生物中是含量最豐富的幾大類轉錄因子超家族之一[1]。核受體的一般途徑為配體與相應核受體結合誘導受體的二聚化并增強其與特定DNA序列的結合[2]，從而激活或抑制下游基因的表達。NR3C2基因的表達范圍很廣，在腎臟極化的緊密上皮、人類和鼠的大腸、氣道、汗腺、唾液腺、肝臟、內皮的上皮組織[3]、脂肪組織[4]及單核細胞、B淋巴細胞和T淋巴細胞、番鴨的肝、腎、腦、腿、膽和胸[5]中均有表達。NR3C2分布的廣泛性揭示了其功能的多樣性，目前研究最多的是與人類疫病相關的功能，比如腎細胞癌[6]、胰腺癌[7]、肝癌[8]等腫瘤發生、高血壓[9]、1型假性醛固酮減少癥[10]、高原肺水腫[11]、慢性中心性漿液性脈絡膜視網膜病變[12]等。此外NR3C2還被發現與人的行為異常[13]及精神分裂[14，15]等有關，近來也有研究表明NR3C2參與脂類代謝，在脂肪性肥胖[16]中發揮作用。在動物中的研究表明，NR3C2的表達水平在番鴨不同行為狀態下存在差異[5]；其單核苷酸變異與豬的肥胖相關[17]；對內洛爾牛進行研究表明，其單倍型與肉色、烹飪損失、肌肉糖原含量和血漿促腎上腺皮質激素濃度等肉質性狀相關[18]；在雞上目前未發現有相關研究報道。本課題組前期研究發現NR3C2基因在雞卵巢顆粒細胞中高表達(未發表)，因此猜測該基因在雞繁殖性能中可能發揮重要作用。

雞NR3C2基因位于4號染色體，共有8個外顯子組成，編碼981個氨基酸。本研究以山東地方雞種和高產蛋雞為素材，采用直接測序和PCRRFLP技術對該基因進行SNP掃描，分析多態位點與雞繁殖性狀的相關性，以期挖掘該基因與山東地方雞繁殖性狀密切相關的分子標記，為地方雞種遺傳改良和創新利用奠定科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

濟寧百日雞396只、汶上蘆花雞522只、萊蕪黑雞392只、海蘭褐蛋雞206只，均來自山東省地方雞品種資源活體基因庫。所有試驗群體均為同批入孵，飼養條件一致，隨機采樣，翅靜脈采血，ACD抗凝，-20℃保存。采用常規酚/氯仿法提取雞血液DNA。萊蕪黑雞單籠飼養，專人負責個體產蛋記錄。

1.2 突變位點及引物信息

根據雞NR3C2基因(GenBank登錄號NC_052535)的DNA序列，設計1對引物，引物序列為F:5′-AGACAGACAGGGATAG-3′，R:5′-GAGGACACTGAGTTAA-3′，擴增目的片段長度771 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 PCR擴增與PCR-RFLP分析

PCR反應體系(15 μL):2×TaqPCR MasterMix 7.5 μL，ddH2O 5.6 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各0.45 μL，基因組DNA(50 ng/μL)1 μL。PCR擴增程序:94℃3 min；94℃30 s，48.1℃30 s，72℃30 s，30個循環；72℃4 min。

PCR-RFLP反應體系(15 μL):TaqⅠ(10U/μL)0.5 μL，10×BufferTaqⅠ1 μL，PCR產物8 μL，ddH2O 5.5 μL，65℃水浴過夜。

酶切產物檢測:120 V、1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，分析酶切產物基因型。

1.4 序列分析

每個基因型取兩個不同個體的PCR產物于濟南力戈科技有限公司進行克隆測序。

1.5 關聯分析

采用SAS 8.1統計軟件包的GLM程序進行基因型與性狀(產蛋數、開產日齡)的關聯分析。統計分析模型為yi＝μ+Gi+ei，其中yi代表性狀表型值，μ為性狀群體均值，Gi代表基因型效應值，ei為隨機殘差。

不同基因型間的比較分析用最小二乘法，試驗數據用最小二乘均值±標準誤(LSM±SE)表示，顯著水平設定P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 基因型判定

由圖1可知，NR3C2基因3 714多態位點經TaqⅠ限制性內切酶酶切后在山東省3個地方雞種和引進高產品種中均表現出3種基因型:GG(417、51、303 bp)，AA(468、303 bp)和GA(468、417、303、51 bp)。

圖1 雞NR3C2基因3 714多態位點酶切結果

2.2 序列分析

測序結果表明(圖2)，雞NR3C2基因3 714位點是一個G→A的突變，該突變位點位于外顯子1內，包含TaqⅠ限制性內切酶的識別序列“T/CGA”，其中“G”不發生突變即“T/CGA”類型記做“GG”；“G”突變為“A”，即“T/CAA”類型記做“AA”；GA為雜合型。

圖2 雞NR3C2基因3 714多態位點的序列分析(反向測序)

2.3 NR3C2基因3 714多態位點等位基因和基因型頻率分布

3 714位點在濟寧百日雞、汶上蘆花雞和萊蕪黑雞3個地方雞種中的優勢基因型均為雜合型GA，頻率約為50.00%，等位基因A和G的頻率也接近平均分布。在高產蛋雞海蘭褐中的優勢基因型為純合型GG，頻率為88.84%，優勢等位基因G頻率為93.93%(表1)。

表1 NR3C2基因3 714多態位點的基因型頻率和等位基因頻率

2.4 NR3C2基因3 714多態位點與產蛋性能的關聯分析

在392只萊蕪黑雞群體中，對NR3C2基因3 714位點與4個繁殖性狀進行關聯分析和多重比較，結果見表2。

表2 NR3C2基因3 714多態位點各基因型與繁殖性能的關聯分析

3 714位點與43W產蛋量(P＝0.0467)、44W產蛋量(P＝0.0486)和45W產蛋量(P＝0.0499)均顯著相關。基因型GG個體的最大產蛋量與基因型GA個體間差異顯著(P＜0.05)，而且該基因型在開產日齡性狀上也表現出優勢，GG基因型個體的開產日齡最早，比GA基因型個體平均早1.17 d。

3 討論與結論

鹽皮質激素受體基因功能非常廣泛[3]，不僅維持水鈉平衡，還與心血管重構、行為認知、脂肪代謝、腦缺血再灌注腦損傷[19]、認知障礙[20]、產后抑郁癥[21]等病理生理反應有關。本研究發現雞NR3C2基因3 714位點GG基因型在低繁殖力的3個山東省地方雞種中表現為劣勢基因型，而在高產蛋雞海蘭褐中表現為優勢基因型，頻率高達88.84%，等位基因G頻率高達93.93%。濟寧百日雞、汶上蘆花雞和萊蕪黑雞均為山東省地方雞種，與國外高產蛋雞品種相比，繁殖力較低，這也是制約地方雞種創新利用的瓶頸因素，而海蘭褐蛋雞是經過長期選擇形成的商業化品系，近年來，基因組育種在其品系育成過程中更是發揮了重要作用，有益基因經過選育在群體內大量聚合，因此，結合品種特點初步推測GG基因型可能與高產蛋性狀有關。

關聯分析結果也表明該位點與萊蕪黑雞多個時期的產蛋量存在顯著相關，GG基因型個體在開產日齡、43W產蛋量、44W產蛋量和45W產蛋量性狀中均表現最優，且在其中3個性狀上與GA基因型個體間差異顯著，可以推斷GG型與高繁殖性能相關，可以用于地方雞種的育種。在地方雞種選育過程中，可選擇GG型個體留種，不但可以將開產日齡提前，還能提高總產蛋量，極大提升地方雞種的繁殖性能，促進地方雞種的創新利用，提高經濟效益。

本研究采用PCR-RFLP方法在汶上蘆花雞、濟寧百日雞、萊蕪黑雞和海蘭褐中檢測到NR3C2基因3 714 nt處發生點突變G→A，基因型GG在3個地方雞種中表現為劣勢基因型，而在高產蛋雞海蘭褐中表現為優勢基因型。關聯分析結果表明3 714位點對43W產蛋量(P＝0.0467)、44W產蛋量(P＝0.0486)和45W產蛋量(P＝0.0499)均表現出顯著相關，且GG基因型個體的開產日齡也最早，比GA基因型個體平均早1.17 d。GG基因型可以作為地方雞種繁殖性狀的分子標記。