大果山楂-甘蔗復合果酒澄清劑的篩選與優化

何思蓮，鐘玉蓮，李品衛，曾呂生，龐國萍，陳淵*

1. 廣西農產資源化學與生物技術重點實驗室，玉林師范學院化學與食品科學學院（玉林 537000）；2. 廣州華糖食品有限公司（廣州 510760）；3. 廣西貴港市甘化集團有限公司（貴港 537100）

大果山楂屬于南山楂的一種，是廣西傳統果品之一，具有悠久的種植歷史。大果山楂具有較高的醫用價值，能增加冠狀動脈血量、加強和調節心肌、降低血壓[1]，已被中華人民共和國國家衛生健康委員會確定為藥食兩用的食品。甘蔗是高產廉價的糖料農作物，含有豐富的維生素、礦物質等元素和抗氧化活性成分[2]，是釀造果酒的良好原料。將二者混合發酵釀造得到復合果酒，使其營養成分和保健功能互補，口感更為全面。但完成發酵的復合果酒在貯藏時，酒體中的果膠質、蛋白質、色素、單寧等大分子成分易發生凝集沉淀，降低果酒品質。通過單因素試驗篩選高效的澄清劑，采用響應面進行復合澄清劑復配比例的優化，進一步確定最佳澄清工藝條件，為經濟有效地澄清大果山楂-甘蔗復合果酒、提高酒體品質和貯藏穩定性提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑與儀器

大果山楂（購于玉林宏進批發市場）；甘蔗汁（初壓汁，采自廣西某糖廠）。

葡萄酒活性干酵母BV818、無水檸檬酸、白砂糖、皂土、殼聚糖、PVPP、明膠、硅藻土等（均為食品級）。

DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；SHZ-82型水浴恒溫振蕩器（江蘇金怡儀器科技有限公司）；JJ500型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；JYZ-V902型九陽榨汁機（九陽股份有限公司）；TDZ5-WS型臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；UV-1600型紫外-可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；HH-S4型數顯恒溫水浴鍋（江蘇金儀儀器科技有限公司）；ST3100型pH計（奧豪斯儀器常州有限公司）。

1.2 果酒制備工藝流程

發酵所得果酒，用不同澄清劑在25 ℃進行澄清處理24 h后，于紫外分光光度計500 nm檢測其透光率。

1) 原料處理：挑選新鮮的大果山楂清洗干凈，除去果蒂和果梗，榨汁，過濾除渣后冷凍備用（固形物含量14.5 °B）；甘蔗初壓汁（糖度17.7%）經4層紗布過濾3次，冷凍備用。

2) 混合：大果山楂汁與甘蔗汁按1∶2（V/V）比例進行混合，混合液在室溫下靜置1 h后，在4 000 r/min的條件下離心10 min，收集上清液備用。

3) 調糖，殺菌：加蔗糖調上清液糖度至20%，加熱煮沸3 min，在75 ℃條件下水浴30 min后，置于冰水冷卻至室溫。

4) 發酵：酵母液（V酵母∶V2%蔗糖液=1∶10）于32 ℃水浴活化30 min，復合果酒接種0.6%（V/V）酵母液，在25 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱發酵72 h。

5) 澄清：不同澄清劑對大果山楂甘蔗復合果酒進行澄清處理24 h后，于紫外分光光度計檢測其透光率。

1.3 澄清劑復配比例優化

以皂土、殼聚糖、PVPP這3種澄清劑為變量因素，以復合果酒透光率為響應值，采用響應面軟件Design Expert V8.0中的Box-Behnken設計進行優化，確定最優復配比例，因素水平見表1。

表1 大果山楂-甘蔗復合果酒澄清試驗的因素水平表單位：g/L

1.4 復合澄清劑澄清時間的確定

在最佳復合配方的基礎上，研究澄清時間為3，6，9，12，15和18 h時果酒的透光率，確定最優澄清時間。

1.5 果酒抗氧化活性的測定

澄清前、后的果酒經稀釋、過濾，測定DPPH（1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基清除率和總還原能力[3]。

2 結果與討論

2.1 皂土、殼聚糖、硅藻土對復合果酒的澄清效果

皂土對復合果酒透光率的影響隨皂土添加量增加，透光率亦上升，可能的原因是復合果酒中含有大量呈正電性的膠體物質，能與帶負電荷的皂土作用而澄清[4]，透光率隨著皂土的添加而上升。添加量增加到1.2 g/L，澄清后果酒透光率達到77.9%，與初始的透光率59.1%相比提高18.8%。添加量大于1.2 g/L，澄清后透光率變化幅度不大，這說明帶負電荷的皂土吸附果酒中大部分帶相反電荷的膠體物質，形成難溶物沉淀之后，皂土添加量繼續增加，果酒的澄清度變化不大[5]。

皂土、殼聚糖、硅藻土對復合果酒的澄清效果如圖1所示。殼聚糖添加量范圍在0.2～0.6 g/L時，復合酒的透光率隨殼聚糖的增加而逐漸上升；在0.6 g/L處澄清效果最佳，復合果酒的透光率由初始的59.1%上升至76.9%；殼聚糖添加量超過0.6 g/L時，透光率反而下降。可能是因為果酒中還存在帶負電的膠體物質如蛋白質、果膠等，帶正電的殼聚糖中和帶負電的物質形成沉淀，達到澄清效果；但殼聚糖添加過量時，殼聚糖吸水膨脹會形成黏性較大的膠狀物，懸浮于酒體中，致使酒體渾濁[6]。

圖1 皂土、殼聚糖、硅藻土對復合果酒透光率的影響

硅藻土添加量范圍在0.2～0.6 g/L時，復合酒的透光率隨硅藻土添加量的增加呈上升趨勢。硅藻土添加量0.6 g/L時，復合酒的透光率達73.5%，與原酒酒體的透光率（59.1%）相比，提升14.4%。硅藻土添加量范圍小于0.6 g/L時，果酒透光率逐漸上升，這與硅藻土具有強吸附性的多孔結構有關。適量的硅藻土可吸附酒體中果膠、酵母、色素等渾濁物一同沉降，使果酒澄清。但硅藻土添加量高于0.6 g/L時，酒體澄清度隨著添加量的增加呈下降趨勢，可能是過量硅藻土成為渾濁物的來源[7]。

2.2 明膠、PVPP對復合果酒的澄清效果

明膠、PVPP對復合果酒的澄清效果如圖2所示。明膠作澄清劑時，明膠中的蛋白質會與單寧發生化學反應，形成黏稠狀物質，進而吸附果酒中的果膠、單寧等膠體物，使其形成難溶物而被去除，從而使果酒澄清[8]。明膠添加量0.02 g/L時，澄清得到的復合酒透光率（71.1%）與原酒酒體的透光率（59.1%）相比，提高12%，明膠添加量超過0.02 g/L時，復合果酒的透光率變化程度較小，這可能是由于山楂中含較多的單寧，甘蔗汁和山楂汁混合發酵過程單寧物質與酒體的蛋白質作用沉淀除去，存留在酒體中單寧物質大幅減少，明膠加入后，澄清作用不明顯。

圖2 明膠、PVPP對復合果酒透光率的影響

PVPP主要吸附引起果酒不穩定的單寧和多酚類物質，加入適量PVPP后，PVPP可吸附單寧絮凝沉淀，進而抑制果酒中蛋白質與單寧的結合，從而提高發酵酒的澄清度[9]。PVPP添加量在0.02～0.06 g/L時，復合果酒的透光率隨PVPP添加量增加而快速上升。添加量大于0.06 g/L，透光率上升幅度不大，PVPP添加量0.1 g/L時，酒體透光率最高達75.0%。PVPP添加量高于0.1 g/L時，復合果酒的透光率下降。楊繼偉[10]使用PVPP澄清甘蔗果酒，結果發現添加適量PVPP，可去除果酒中含有的多酚類物質，提高果酒透光率，而PVPP添加過量時，部分的PVPP懸浮于果酒中導致澄清度降低。

2.3 復合澄清劑配方優化試驗

單因素試驗結果表明，5種澄清劑對大果山楂-甘蔗復合果酒均有一定澄清效果。選取單因素試驗澄清效果較好的皂土、殼聚糖、PVPP這3種澄清劑進行復配，以復合果酒透光率為指標進行響應面試驗優化復配配方。17組試驗結果見表2。對試驗數據進行方差分析及回歸系數顯著性檢驗，結果見表3。統計模型P＜0.000 1，表明回歸模型極顯著。R2=0.992 8，Radj2=0.983 5，R2pre=0.913 7，表明試驗誤差小，模型與數據的擬合度高，模型擬合建立的二次多項式回歸方程為透光率=71.8+14.6A+16.8B+68.3C-5.7AB-23.3AC-25.0BC-4.5A2-12.2B2-250.0C2。

表2 響應面試驗設計及結果

表3 透光率回歸模型的顯著性和方差分析

該模型可以預測和分析復合澄清劑對復合果酒澄清效果的影響。在各因素中，一次項A、B對復合果酒澄清的效果極顯著（P≤0.01），澄清效果的大小順序為皂土（A）＞殼聚糖（B）＞PVPP（C），這結果與單因素試驗的結果相同。二次項A2、B2和交互項AB對復合果酒澄清的效果極顯著（P＜0.01），而交互項BC對復合果酒澄清的效果不顯著（P＞0.1）。這表明各試驗因素對復合果酒澄清效果存在一定的交互作用。

根據響應面模型，預測的復合澄清劑最佳質量濃度為皂土1.20 g/L、殼聚糖0.34 g/L、PVPP 0.06 g/L，澄清后果汁透光率為85.7%。采用所得出的最佳復合配比進行驗證試驗，平行測3組，試驗測得的透光率為85.4%±0.8%，與模型預測基本一致，較初始的透光率提高26.3%，說明復合澄清劑效果優于單一澄清劑。

2.4 復合澄清劑澄清時間的確定

采用最優配方的復合澄清劑對大果山楂-甘蔗復合果酒進行澄清，澄清時間對果酒透光率的影響結果如圖3所示。澄清時間3～12 h時，復合果酒酒體的澄清度隨時間遞增，澄清時間大于12 h，酒體澄清度開始下降，可能是因為靜置時間長，果酒中微生物的新陳代謝作用，也會破壞果酒中膠體平衡，從而造成酒體混濁失光[11]。澄清時間9 h時，所得到的酒體透光率為89.7%±0.8%，澄清時間12 h時，所得到的酒體透光率為90.6%±0.8%，較初始的透光率（59.1%）提高30.5%。考慮到實際生產和微生物的作用，選擇澄清時間9～12 h為宜。結果表明，復合澄清劑的最佳澄清時間比單一澄清劑的最佳澄清時間24 h有大幅縮短。

圖3 澄清時間對復合果酒透光率的影響

2.5 澄清前后果酒抗氧化能力

大果山楂-甘蔗復合果酒在澄清前和澄清后的DPPH自由基清除能力和還原能力結果分別如圖4和圖5所示。結果表明，大果山楂-甘蔗復合果酒具有較好的抗氧化能力。澄清后果酒的DPPH自由基清除率略有提高，可能的原因是復合澄清劑中的皂土和殼聚糖都帶有一定的電荷數，使用復合澄清劑澄清果酒后，可使酒體的電子供體增加，DPPH自由基清除率升高。澄清后果酒的總還原能力略有下降，可能的原因是復合澄清劑中的PVPP吸附具有抗氧化作用的多酚和黃酮類物質[12]。

圖4 澄清前后的DPPH自由基清除率

圖5 澄清前后的總還原能力

3 結論

通過5種澄清劑皂土、殼聚糖、PVPP、硅藻土、明膠對大果山楂-甘蔗復合果酒進行澄清試驗，結果表明它們均有一定澄清作用，其中皂土、殼聚糖、PVPP的澄清效果較好。

在單因素試驗基礎上，以澄清率為指標，通過響應面優化試驗對復合澄清劑配方進行優化。結果表明：皂土、殼聚糖、PVPP復合澄清劑要比單一澄清劑的澄清效果好，當復合澄清劑最佳質量濃度為皂土1.20 g/L、殼聚糖0.34 g/L、PVPP 0.06 g/L時，24 h澄清處理后大果山楂-甘蔗復合果酒透光率可達85.4%± 0.8%。復配澄清劑最佳澄清時間為9～12 h，所得到的酒體透光率最高可達90.6%±0.8%，較單一澄清劑最佳的澄清時間大大縮短。選用復合澄清劑澄清對果酒的抗氧化活性影響不大，澄清后果酒的DPPH自由基清除率略有提高，澄清后果酒的總還原能力略有下降。