植物乳桿菌高密度發酵

張國柱，宮俊峰，趙玉明，彭曉光，麻杰，王慕華*

1. 山西維爾生物乳制品有限公司（太原 030006）；

2. 山西省生物研究院有限公司醫藥生物技術山西省重點實驗室（太原 030006）

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為乳桿菌科乳桿菌屬，同型發酵，最適生長溫度為30～35 ℃，最適pH在6.5左右，兼性厭氧，耐鹽、耐酸，是一種重要益生菌[1-2]，具有調節動物胃腸道菌群平衡、改善腸道內環境、增強免疫力和抵抗力等多種功能[3-7]，在食品、飼料及醫療保健等領域有著廣泛應用[8-10]。獲得植物乳桿菌高密度培養物對其商業化生產具有重要意義。不同發酵工藝對其生長有不同影響，通過培養基成分的優化獲得高密度細胞是最為經濟、有效的途徑[11]。為充分發揮菌種的生產能力實現高產，不僅需要擁有一個良好的發酵培養基，還需要對發酵條件進行優化[12]。試驗探究培養基成分對植物乳桿菌生長的影響，確定優化培養基配方。同時，對植物乳桿菌的培養方式、發酵溫度、培養基初始pH、接種量進行研究，旨在獲得植物乳桿菌的最佳發酵條件，提高菌體生物量，為植物乳桿菌高密度發酵提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌SX68（山西省生物研究院有限公司分離、保藏[12]）。

MRS液體培養基：蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏5 g/L、酵母浸膏4 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、乙酸鈉5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.05 g/L、吐溫80 1.0 mL/L，pH 6.5，用蒸餾水定容至1 000 mL，于121 ℃滅菌15 min。

MRS固體培養基：MRS液體培養基中加入20 g/L瓊脂粉，于121 ℃滅菌15 min，用于活菌計數。

葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸三銨、吐溫80等（國產分析純）；麥芽糖、可溶性淀粉、酵母粉、酵母浸膏、蛋白胨、牛肉浸膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨等（生物試劑）。

1.2 儀器與設備

BJ-2CD超凈工作臺（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；YXQ-70A立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；SPX-150B-Z生化培養箱（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；FE28-standard pH計（瑞士梅特勒-托利多公司）；MTV-1漩渦振蕩器（杭州奧盛儀器有限公司）；DK-8D電熱恒溫水浴槽（常州諾基儀器有限公司）；UV-1500分光光度計（上海美析儀器有限公司）；C-32厭氧培養盒（日本三菱瓦斯化學株式會社）。

1.3 方法

1.3.1 參數測定

菌體生物量測定：培養液稀釋適當倍數后，以稀釋相同倍數同一批次滅菌而未接入菌種的MRS液體培養基為參照，經UV-1500分光光度計測600 nm波長處的吸光度。

活菌計數：采用平板菌落計數法，厭氧培養統計植物乳桿菌活菌數。

pH測定：FE28-standard pH計測定。

1.3.2 植物乳桿菌生長曲線繪制

將活化好的植物乳桿菌接種于MRS液體培養基中，在37 ℃下靜置培養，每間隔2 h取樣測定培養液pH和吸光度（A），繪制菌體生長曲線。

1.3.3 最佳碳源的確定

分別以20 g/L麥芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、可溶性淀粉替換MRS液體培養基中的碳源，2%接種量，在37 ℃下三角瓶靜置培養18 h，測定吸光度，確定最佳碳源；將最佳碳源分別以10，15，20，25和30 g/L的質量濃度加入MRS液體培養基中，在2%接種量、37 ℃下三角瓶靜置培養18 h，測定活菌數，確定最佳添加量。

1.3.4 最佳氮源的確定

分別以20 g/L玉米漿干粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、牛肉浸膏替換MRS液體培養基中的氮源，在2%接種量、37 ℃下三角瓶靜置培養18 h，測定吸光度，比較各氮源的影響。在此基礎上，玉米漿干粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨中選最好的1種，酵母粉、酵母浸膏中選較好的1種，與牛肉浸膏組合形成最佳氮源復配方案，確定最佳組合中各氮源添加量。

1.3.5 緩沖鹽、生長因子對植物乳桿菌發酵的影響

分別將緩沖鹽2 g/L磷酸氫二鈉、2 g/L磷酸氫二鉀、5 g/L乙酸鈉、2 g/L檸檬酸三銨或生長因子0.2 g/L硫酸鎂、0.05 g/L硫酸錳單一加入MRS液體培養基中，在2%接種量、37 ℃下三角瓶靜置培養18 h，測定吸光度，確定影響比較大的緩沖鹽和生長因子。

1.3.6 發酵培養基優化

采用四因素三水平L9(34)正交表進行優化試驗，將影響菌體生物量的主要因素碳源、氮源、緩沖鹽和生長因子作為影響因素進行正交試驗，以得到最佳發酵培養基配比。

1.3.7 發酵條件優化

采用四因素三水平L9(34)正交表進行優化試驗，將影響菌體生物量的主要因素接種量、發酵溫度、起始pH、溶氧量作為影響因素進行正交試驗，以得到最佳發酵條件。

2 結果與討論

2.1 植物乳桿菌MRS液體培養的生長曲線

植物乳桿菌接種于MRS液體培養基中，每間隔2 h取樣測定發酵液pH和吸光度，繪制菌體生長曲線及pH變化情況曲線，如圖1所示。

從圖1中可知，植物乳桿菌在MRS液體培養基中，8 h進入對數期，18 h達到穩定期，pH由起始的6.5降到3.3。因此，可以確定植物乳桿菌的發酵時長達到18 h即可。

圖1 植物乳桿菌生長曲線及培養過程中的pH變化曲線

2.2 不同碳源對植物乳桿菌生長的影響

麥芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、可溶性淀粉替換MRS液體培養基中的碳源，發酵培養18 h后，測定吸光度，考察不同碳源對植物乳桿菌生長的影響，如圖2所示。確定最佳碳源后，設定不同添加量，考察不同濃度對植物乳桿菌生長的影響，如圖3所示。

圖2 不同碳源對植物乳桿菌生長的影響

圖3 不同蔗糖質量濃度對植物乳桿菌生長的影響

從圖2中可知，麥芽糖、乳糖、蔗糖對植物乳桿菌生長的影響和葡萄糖差異不大，菌體生長量A600nm基本都在10左右，考慮到可將食品級蔗糖添加到培養基中，降低發酵成本，因此，選擇蔗糖作為最佳碳源。從圖3中可知，蔗糖添加量為25 g/L最適于植物乳桿菌的生長。

2.3 不同氮源對植物乳桿菌生長的影響

玉米漿干粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、牛肉浸膏替換MRS液體培養基中的氮源，發酵培養18 h后，測定吸光度，考察不同氮源對植物乳桿菌生長的影響，如圖4所示。

圖4 不同氮源對植物乳桿菌生長的影響

蛋白胨含有豐富的氨基酸，特別是含硫氨基酸較多，還含有細菌生長需要的維生素和其他生長因子，是各種培養基制備的基礎原材料，主要作用是提供氮源；酵母膏含有氨基酸類、肽類、水溶性維生素、酵母多糖、酵母核酸等，在培養基中可補充氮源和提供細菌生長的各種維生素及氨基酸；牛肉膏含有肌酸、肌酸酐、多肽類、氨基酸類、核苷酸類、有機酸類、礦物質類及維生素類的水溶性物質，在培養基中的主要作用是補充蛋白胨及其他氮源的營養不足。乳酸菌培養營養要求苛刻，因此考慮將3種氮源復配使用，以期達到較好的效果。從圖4中可知，胰蛋白胨的效果優于其他2種蛋白胨，酵母膏和酵母粉效果差不多，選較便宜的酵母膏。按總添加量20 g/L計，胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏的比例分別設置1∶1∶1，2∶1∶1和3∶2∶1，比較不同氮源復配比例的影響，如圖5所示。由圖5可知，胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏按3∶2∶1的比例復配，最有益于植物乳桿菌的生長。

圖5 不同氮源復配比例對植物乳桿菌生長的影響

2.4 緩沖鹽、生長因子對植物乳桿菌生長的影響

在MRS液體培養基中分別只添加2 g/L磷酸氫二鈉、2 g/L磷酸氫二鉀、5 g/L乙酸鈉、2 g/L檸檬酸三銨中的一種和0.2 g/L硫酸鎂、0.05 g/L硫酸錳中的一種，考察不同緩沖鹽、生長因子對植物乳桿菌生長的影響，如圖6所示。

從圖6中可知，緩存鹽磷酸氫二鉀、微量生長因子硫酸錳對植物乳桿菌生長的影響較大。

圖6 不同緩沖鹽、生長因子對植物乳桿菌生長的影響

2.5 發酵培養基優化

在單因素試驗的基礎上，以對植物乳桿菌生長影響較大的蔗糖、復配氮源（胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏3∶2∶1）、磷酸氫二鉀、硫酸錳作為不同的因素，設計正交試驗，進行發酵培養基配方優化，如表1所示。培養基中其他成分及添加量分別為乙酸鈉5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、吐溫80 1.0 mL/L。

表1 發酵培養基正交優化

從表1可知，不同因素對菌株高密度培養影響大小依次為蔗糖＞氮源＞硫酸錳＞磷酸氫二鉀。最佳添加量為蔗糖25.0 g/L、氮源24.0 g/L、硫酸錳0.07 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L。氮源按胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏3∶2∶1分配為胰蛋白胨12 g/L、牛肉浸膏8 g/L、酵母膏4 g/L。最優培養基組成為胰蛋白胨12 g/L、牛肉膏8 g/L、酵母膏4 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、檸檬酸三胺2 g/L、乙酸鈉5 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸鎂 0.07 g/L、吐溫80 1 mL/L、pH 6.4。用此培養基10 L發酵罐發酵，最高A600nm可達14.38，平板活菌計數，活菌量可達1.64×1012CFU/mL。

2.6 發酵條件優化

在10 L發酵罐單因素試驗基礎上，以生物量（A600nm）為評價指標，以接種量、發酵溫度、起始pH、溶氧量作為影響因素，正交試驗優化發酵條件，如表2所示。

從表2可知，不同因素對菌株高密度培養影響大小依次為起始pH＞發酵溫度＞接種量＞溶氧。最佳發酵條件為起始pH 6.5，發酵溫度35 ℃，接種量20 mL/L，溶氧量0 mL/L。確定最優發酵條件為起始pH 6.5、發酵溫度35 ℃、接種量20 mL/L、溶氧量0 mL/L（控制低于100 mL/L），攪拌轉速50 r/min，罐壓0.03 MPa。在最佳發酵培養基配方及發酵條件下，最高A600nm可達15.72，活菌數可達9.63×1012CFU/mL。

表2 發酵條件正交優化

3 結論

通過植物乳桿菌生長曲線的繪制，可以確定其在MRS液體培養基中18 h進入穩定期，因此，在后續試驗中可將18 h確定為發酵的終點。通過液體發酵培養基的優化，確定植物乳桿菌的最優發酵培養基配方：胰蛋白胨12 g/L、牛肉膏8 g/L、酵母膏4 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、檸檬酸三胺2 g/L、乙酸鈉5 g/L、硫酸鎂 0.58 g/L、硫酸鎂0.07 g/L、吐溫80 1 mL/L、pH 6.4。通過培養基配方優化，菌體生長量從MRS液體培養基中的A600nm的10.53提高到14.38，蔗糖可以替代葡萄糖作為碳源，節約生產成本。通過發酵條件的優化，最終確定植物乳桿菌的最優發酵條件：起始pH 6.5，發酵溫度35 ℃，接種量20 mL/L，溶氧量0 mL/L（控制低于100 mL/L），攪拌轉速50 r/min，罐壓0.03 MPa。在最優發酵條件下，植物乳桿菌最高A600nm值可達15.72，活菌數可達9.63×1012CFU/mL，植物乳桿菌的菌體生物量提高顯著。植物乳桿菌高密度發酵的研究為今后工業化生產植物乳桿菌奠定基礎，具有較好的經濟效益、社會效益和發展前景。