綠豆萌發過程中蛋白質的變化及分離純化研究

郭靜婕，趙琤，陸燕飛，鄧晨曉

廣西農業職業技術大學（南寧 530007）

綠豆芽，是指綠豆經浸泡后生出的嫩芽，下胚軸是其主要的食用部分。綠豆芽有很高的藥用價值，中醫認為，綠豆芽性涼味甘，解暑清熱、通經脈、解毒利尿、消水腫、滋陰壯陽、調理五臟六腑、美膚、去濕熱，還能降血脂和軟化血管[1]。綠豆芽中的蛋白質可分解成易被人體吸收的游離氨基酸，同時還含有磷、鋅等礦物質，以及維生素B2、胡蘿卜素等多種維生素，綠豆芽具有一定的減肥功效，成為減肥餐的首選蔬菜之一[2]。2020年，全球豆芽市場規模達269億元，預計2026年將達287億元，年復合增長率為0.9%，我國是最大的豆芽生產及銷售市場，約占世界87%的市場份額[3]。綠豆萌發設備簡易、工藝流程簡單，家庭作坊均可滿足生產條件，一年四季都可以生產，每千克綠豆可產豆芽10～15 kg，回報豐厚、利潤可觀，因此新鮮綠豆芽是綠豆的主要產品之一。綠豆在發芽過程中，蛋白質和糖類物質雖在含量上有所下降，但維生素和膳食纖維等含量大幅提高，部分蛋白質也會分解為各種人體所需的氨基酸，可達到綠豆原含量的7倍[4-6]，所以豆芽也被稱為“活體蔬菜”。綠豆在發芽的過程中，蛋白質含量呈現動態變化過程[7]，在多種酶的作用下，各種有機物質被釋出，更容易被人體充分吸收和利用[8]，同時綠豆在發芽過程中多酚類物質明顯增加，類黃酮含量減少，生物效價和利用率大幅提高，抗氧化保健功能顯著增強[9]。綠豆芽主要以鮮食為主，在深加工研究方面只局限于榨汁和干燥，因此綠豆芽的深加工存在很大的研究空間[10]。為此，試驗以綠豆為原料，探討綠豆萌發過程中蛋白質的變化及分離純化，為從綠豆芽中分離出優質蛋白質奠定基礎，對于綠豆芽食品的科學開發及綜合利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆（購買于大潤發超市）；牛血清蛋白（西班牙分裝進口）；考馬斯亮藍G250（國藥集團化學試劑有限公司）；葡聚糖凝膠LH-20（上海士鋒生物科技有限公司）；葡糖糖聚凝膠G100（上海士鋒生物科技有限公司）；瓊脂糖凝膠CM（上海士鋒生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

T6新世紀紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；DB5-100電腦自動部分收集器（上海瀘西分析儀器廠有限公司）；AL-2B恒流泵（上海青浦瀘西儀器廠）；TG16-ws臺式高速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；QL-901漩渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；1.6 cm× 30 cm層析柱（上海瀘西分析儀器廠有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 綠豆芽培養

稱取50 g綠豆，加入適量的水浸泡8 h后將水濾干，把綠豆放入漏盆置于在陰暗處蓋上紗布，按1，2，3和4 d進行發芽，其間要適時澆水保持紗布濕潤。

1.3.2 樣品處理

稱取100 g 1.3.1小節方法培養的綠豆芽，加2倍的水，放入打漿機打漿1 min，并在20 ℃下保溫30 min。紗布過濾，取濾液離心（12 000 r/min）10 min后，取上清液備用。

1.3.3 鹽析

取20 mL上述上清液，加入硫酸銨粉末，使溶液中硫酸銨達到80%的飽和度，充分攪拌，使其完全溶解，靜止24 h。離心（12 000 r/min）10 min，棄去上清液，收集沉淀物。在沉淀物中加入蒸餾水，攪拌，使其完全溶解，定容至20 mL。

1.3.4 透析

將鹽析后的粗提液裝入處理過的透析袋（用0.01 mol/L的醋酸浸泡1～2 h，用蒸餾水浸泡3～5 h，中間換1～2次純凈水）內。將裝有粗提液的透析袋放置燒杯中，加入0.01 mol/L的pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，浸泡24 h，其間換1～2次磷酸鹽緩沖液。收集透析后的粗提液。上柱時取1 mL粗提液，加9 mL純凈水，稀釋備用。

1.3.5 蛋白質的測定

試驗采用考馬斯亮藍法G-250測定蛋白質濃度。考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合后變成深藍色，在595 nm處有最大吸收峰，且其吸光度與蛋白質含量（10～100 μg/mL蛋白質濃度）呈正比。

1.3.6 凝膠柱層析

裝柱，將溶脹好的凝膠一次性裝入柱內，并避免柱內產生氣泡或斷層；平衡，用3～5個柱體積的平衡液流過柱子直到基線變得平穩為止；連接自動部分收集器和恒流泵；上樣，樣品用0.45 μm濾膜過濾，去除色素；洗脫流速控制在約3.5 mL、5 min，每管收集3 mL左右，并在280 nm下測定吸光度A。

2 結果與分析

2.1 不同層析分離介質對綠豆芽蛋白質分離純化效果的影響

2.1.1 G100凝膠柱層析洗脫曲線

將透析得到的粗提液用G100凝膠柱層析進行分離所得的洗脫曲線如圖1所示。

圖1 G100凝膠柱層析洗脫曲線

洗脫過程中蛋白質共出現3個紫外吸收峰，即分離出3種蛋白質。經測定3種蛋白質的質量濃度分別為361，704和36 μg/mL。

2.1.2 LH-20凝膠柱層析洗脫曲線

將透析得到的粗體液用LH-20凝膠柱層析進行分離，所得的洗脫曲線如圖2所示。

圖2 LH-20凝膠柱層析洗脫曲線

洗脫過程中蛋白質共出現3個紫外吸收峰，即分離出3種蛋白質。經測定3種蛋白質的質量濃度分別為69，45和33 μg/mL，蛋白質的濃度相對偏低。

2.1.3 CM凝膠柱層析洗脫曲線

將透析得到的粗體液用CM凝膠柱層析進行分離，所得的洗脫曲線如圖3所示。

圖3 CM凝膠柱層析洗脫曲線

洗脫過程中蛋白質只出現1個紫外吸收峰，蛋白質濃度為422 μg/mL，表明用CM凝膠柱層析只能分離出一種蛋白質，不適用于試驗中豆芽蛋白質的分離。

2.2 萌發天數對綠豆芽蛋白質變化的影響

2.2.1 萌發1 d綠豆芽中蛋白質的分離純化

綠豆芽發芽1 d后，粗提液經過G100凝膠柱層析分離，得到3個洗脫峰，如圖4所示。經測定3種蛋白質的濃度分別為2 138，58 310和0 053 μg/g，其中大分子蛋白質占主要優勢。

圖4 綠豆萌發1 d蛋白質的分離純化曲線

2.2.2 萌發2 d綠豆芽中蛋白質的分離純化

綠豆發芽2 d后，粗提液經過G100凝膠柱層析分離，得到3個洗脫峰，如圖5所示。經測定3種蛋白質的濃度分別為6 155，33 189和18 706 μg/g，大分子蛋白質略有下降，而小分子蛋白質濃度相對第1天時明顯增加。

圖5 綠豆萌發2 d蛋白質的分離純化曲線

2.2.3 萌發3 d綠豆芽中蛋白質的分離純化

綠豆發芽3 d后，粗提液經過G100凝膠柱層析分離，得到3個洗脫峰，如圖6所示。經測定3種蛋白質的濃度分別為22 431，13 931和4 483 μg/g，大分子蛋白質保持優勢，而小分子蛋白質濃度顯著下降。

圖6 綠豆萌發3 d蛋白質的分離純化曲線

2.2.4 萌發4 d綠豆芽中蛋白質的分離純化

綠豆發芽4 d后，粗提液經過G100凝膠柱層析分離，得到3個洗脫峰，如圖7所示。經測定3種蛋白質的濃度分別為9 603，14 086和983 μg/g。3種蛋白質濃度相對萌發初期下降顯著。

圖7 綠豆萌發4 d蛋白質的分離純化曲線

2.3 綠豆芽萌發過程總蛋白質含量的變化

圖8為綠豆芽發芽過程中總蛋白的含量變化圖。綠豆萌發在1～4 d過程中，總蛋白質含量一直處于動態變化中，并呈現逐漸下降趨勢，蛋白質含量從29 800 μg/g下降至9 155 μg/g。

圖8 綠豆芽萌發過程總蛋白質含量的變化

3 討論

試驗中，分別選用葡聚糖凝膠G100、葡聚糖凝膠LH-20、瓊脂糖凝膠CM為柱層析介質分離純化綠豆芽蛋白質。樣品通過G100洗脫后得到3個洗脫峰，且分離純化后的蛋白質濃度較高；樣品通過葡聚糖凝膠LH-20洗脫后同樣得到3個洗脫峰，但分離純化后的蛋白質濃度偏低；樣品通過瓊脂糖凝膠CM洗脫后，僅得到1個洗脫峰。葡聚糖凝膠是一種珠狀的凝膠，含有大量羥基，很容易在水中和電解質溶液中溶脹，在水、鹽溶液、堿和弱酸性溶液中都非常穩定。G型的葡聚糖凝膠有各種不同的交聯度，葡聚糖凝膠G100的分離范圍在2 000～120 000，基本滿足綠豆的幾種主要蛋白質的分離純化[11]，因此，葡聚糖凝膠G100適合用于分離純化綠豆芽蛋白質。

綠豆在萌發過程中，蛋白質呈現一個動態變化的過程，隨著萌發天數的增加，蛋白質總含量逐漸降低。綠豆吸水膨脹伸出胚根及胚芽同時綠豆蛋白酶被激活，綠豆中的蛋白質在蛋白酶的作用下分解成游離態的氨基酸供綠豆胚芽生長，在萌發過程中由于生長機制所需又有一部份新的蛋白質被合成，但蛋白質的分解速度大于合成速度，因此測得的總蛋白質含量隨著萌發時間逐漸下降[12]。

根據葡聚糖凝膠G100柱層析的分離原理，在分離純化過程中，分子量大的蛋白質比分子量小的蛋白質先洗脫出來，綠豆萌發1 d時是以大分子的蛋白質為主（第一峰和第二峰）。綠豆萌發2 d時小分子蛋白質濃度明顯增加（第三峰），是因為一部分大分子蛋白質在綠豆蛋白酶的作用下降解為可溶性小分子蛋白質或氨基酸，為綠豆的萌發提供能量[13]。綠豆萌發3和4 d時小分子蛋白質（第三峰）濃度逐漸降低，大分子蛋白質濃度總體呈下降趨勢，第一峰蛋白質呈先上升后下降趨勢，第二峰蛋白質呈先下降后上升趨勢，因為綠豆芽在萌發過程中蛋白質分解為人體更易消化吸收的游離氨基酸[14]，還有一些微量元素會在一定程度上富集，增強綠豆芽的保健功能[15]，同時也不斷有新的蛋白質合成供植株生長發育[16]，因此綠豆芽蛋白質總含量呈現逐漸下降趨勢。

4 結論

在綠豆芽萌發1～4 d的過程中，綠豆芽蛋白質呈現逐漸下降的趨勢，從第1天最高的29 800 μg/g下降至第4天的9 155 μg/g。在綠豆萌芽發過程中蛋白質一直處于動態變化的過程，蛋白質在各種酶的作用下被分解為小分子蛋白質和氨基酸，同時也有新的蛋白質被合成，通過葡聚糖凝膠G100分離純化綠豆芽蛋白質，可分離出3種蛋白質，為從綠豆芽中分離出優質蛋白質奠定基礎。