離子色譜-電導(dǎo)法檢測(cè)液體乳中的硫氰酸根

鄒沫君

樂(lè)山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（樂(lè)山 614000）

硫氰酸根為無(wú)色、易揮發(fā)、具有強(qiáng)烈氣味的酸性液體，有毒。其毒性主要由其在體內(nèi)釋放的氰根離子而引起，氰根離子在體內(nèi)能快速與細(xì)胞色素氧化酶中的三價(jià)鐵離子結(jié)合，抑制該酶活性，使組織不能利用氧，引起惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等腸道功能紊亂，血壓波動(dòng)，心率減慢，重度中毒可致腎功能明顯損害，慢性毒性可抑制碘的運(yùn)轉(zhuǎn)和甲狀腺激素合成，惡化碘缺乏癥[1-3]。自然界中也含有硫氰酸根，硫氰酸根被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物血液中一種常見(jiàn)的電解質(zhì)，在動(dòng)物、人體組織和分泌物中都能檢測(cè)到，屬于防御系統(tǒng)的一部分，如在初乳和患乳房炎奶牛的乳中濃度較高，是對(duì)硫代糖苷（葡糖異硫氰酸鹽）和生氰糖苷脫毒處理的一種產(chǎn)物，因此牛乳中本身含有硫氰酸根[4-6]。有文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)加入微量的硫氰酸鹽和過(guò)氧化氫（分別約為12 mg/L和8.5 mg/L），會(huì)在牛奶中獲得較好抗菌的乳過(guò)氧化物酶（LP）體系活動(dòng)，可作為一種牢靠的抑菌保鮮方法用于保存冷卻過(guò)的或未冷卻過(guò)的生奶[7-9]。

近幾年來(lái)食品安全事故頻繁發(fā)生，有些不法奶戶為了延長(zhǎng)原料乳的保質(zhì)期，人為加入硫氰酸根作為生牛奶保鮮劑，使其成為摻假物質(zhì)之一[10-12]。我國(guó)加大對(duì)食品安全方面的工作力度，2008年發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》中明確規(guī)定乳及乳制品中硫氰酸鹽屬于違法添加物質(zhì)，不可以作為乳及液態(tài)奶的添加劑[13-15]。

此次研究探索建立了梯度淋洗-電導(dǎo)檢測(cè)液體乳中硫氰酸根的離子色譜法，試樣用乙腈沉淀蛋白，上清液加水稀釋并經(jīng)固相萃取柱凈化后，用陰離子交換色譜柱IonPac AS 19分離，電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)，測(cè)定液體乳中硫氰酸根的含量，旨在對(duì)液體乳中硫氰酸根快速靈敏的檢測(cè)提供參考，達(dá)到有效監(jiān)控液體乳中硫氰酸根含量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

液體乳（市售）；硫氰酸根SCN-標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 μg/mL，Lot Number P2-SCN675949，Inorganic Ventures）；乙腈（色譜純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水（電阻率18.25 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo ScientificTMICS-1100離子色譜系統(tǒng)、Dionex OnGuard RP小柱（1.0 mL，Thermo SCIENTIFIC公司）；TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）；UVS-3渦旋混合儀（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）；STAR星系列超純水機(jī)（上海礫鼎水處理設(shè)備有限公司）；0.22 μm水系PES慮膜（頗爾公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

分析柱IonPac AS 19分離柱（250 mm×4 mm，Thermo SCIENTIFIC公司）及IonPac AG 19保護(hù)柱（50×4 mm，Thermo SCIENTIFIC公司）；淋洗液源（帶有CR-ATC的EGC II KOH）。梯度淋洗條件：0～18.0 min，50 mmol/L KOH；18.1～23.0 min，70 mmol/L KOH；23.1～25.0 min，50 mmol/L KOH；檢測(cè)器采用電導(dǎo)檢測(cè)；抑制器ASRS ULTRA II 4 mm，自循環(huán)電抑制，電流124 mA；流速1.0 mL/mm；柱溫30 ℃；定量環(huán)500 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確移取一定量的硫氰酸根SCN-標(biāo)準(zhǔn)品，用水逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為0，0.05，0.10，0.20，0.40，0.80和1.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在1.3.1的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以硫氰酸根SCN-質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制硫氰酸根SCN-峰面積-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 試樣制備

1.3.3.1 提取

準(zhǔn)確稱取4.0 g（精確至0.01 g）試樣于25 mL離心管中，加入5 mL乙腈，渦旋混勻，常溫下沉降10 min。在10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液備用。

1.3.3.2 凈化

取1 mL上述備用的上清液，用水稀釋定容至10 mL，混勻后依次通過(guò)0.22 μm水系進(jìn)口聚醚砜PES濾膜，OnGuard RP小柱除去試樣中的脂肪，進(jìn)樣檢測(cè)。OnGuard RP小柱使用前依次用5 mL甲醇和10 mL純水活化，放置20 min后備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 試樣前處理?xiàng)l件的選擇

液體乳中含有大量蛋白質(zhì)、脂肪等大分子物質(zhì)，需要在進(jìn)入色譜柱之前除去，否則會(huì)被吸附在柱內(nèi)，不易洗脫，導(dǎo)致柱效急劇下降。常用去蛋白的方法有酸沉降、鹽沉降、有機(jī)溶劑沉降等方法。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，試驗(yàn)選用牛奶-乙腈（4∶5，V/V）沉降蛋白，沉降時(shí)間10 min，效果顯著。渦旋振搖提取法提高硫氰酸根SCN-提取率，依次通過(guò)0.22 μm水系濾膜、OnGuard RP小柱，利用共價(jià)吸附作用，捕獲殘余的大分子有機(jī)物，減少對(duì)色譜柱的污染。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

液體乳中常含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，因此在測(cè)定其中硫氰酸根時(shí)，需要選用柱容量較高的分析柱。IonPac AS 19離子色譜柱是Dionex在聚合物鍵合技術(shù)方面的新進(jìn)展，用高容量樹(shù)脂（柱容量60 ueq，240 ueq；粒徑7.5 μm）優(yōu)化柱子對(duì)硫氰酸根的選擇性，確保在使用抑制性電導(dǎo)檢測(cè)的情況下，即使存在超高濃度的其他陰離子，也能通過(guò)使用KOH梯度實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度硫氰酸根的定量測(cè)定。同時(shí)，這種聚合物親水性非常好，對(duì)KOH淋洗液選擇性很好，可以使用較高濃度的淋洗液。因此選用IonPac AS19作為分析柱，對(duì)硫氰酸根的分離具有時(shí)間短、分離度高、峰形對(duì)稱等優(yōu)點(diǎn)。

2.2.2 淋洗液系統(tǒng)選擇

CO32-型和OH-型是離子色譜分析陰離子常用的2種淋洗液。其中，在色譜分析中應(yīng)用范圍最廣的為CO32-型，但因其經(jīng)抑制器轉(zhuǎn)化后為碳酸，碳酸部分電離出碳酸根離子與氫離子，導(dǎo)致背景電導(dǎo)較高，水負(fù)峰較大，靈敏度降低，需要對(duì)試樣進(jìn)行濃縮等前處理，不適合大體積直接進(jìn)樣與梯度淋洗。然而，OH-型淋洗液克服上述不足，在線產(chǎn)生系統(tǒng)電解水生成高純KOH，經(jīng)抑制器轉(zhuǎn)化為水，沒(méi)有碳酸鹽污染，具有較小的水負(fù)峰與較高的靈敏度，可以得到較好的保留時(shí)間重現(xiàn)性與較低檢出限。因此，選擇OH-型體系。

2.2.3 淋洗液濃度選擇

淋洗液濃度的選擇關(guān)系到待測(cè)組分SCN-與試樣中無(wú)機(jī)陰離子的分離效果評(píng)價(jià)及出峰時(shí)間的確定。硫氰酸根是易極化陰離子，疏水性強(qiáng)，在陰離子交換柱上保留相對(duì)較強(qiáng)，因此一般情況下需要濃度較高的淋洗液進(jìn)行梯度淋洗，才能得到更好的效果。試驗(yàn)選擇50 mmol/L KOH進(jìn)行等度淋洗，待SCN-出峰后，使用高濃度70 mmol/L KOH淋洗液沖洗5 min分析柱，將吸附在柱上的強(qiáng)保留性物質(zhì)洗脫下來(lái)，經(jīng)平衡回到起始濃度。因此選用50～70 mmol/L KOH梯度淋洗作為試驗(yàn)條件，既克服試樣中基體離子的干擾，又大幅縮短SCN-保留時(shí)間，實(shí)現(xiàn)其迅速完美分離。

2.2.4 流速和柱溫耐受性考察

分別考察采用不同流速及柱溫進(jìn)行測(cè)定時(shí)色譜行為的變化，如表1所示，以硫氰酸根質(zhì)量濃度計(jì)，不同流速條件下SRSD值為0.67%，不同柱溫條件下SRSD值為0.71%。結(jié)果表明，在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中色譜條件（流速及柱溫）有微小變化時(shí)，硫氰酸根含量測(cè)定條件較寬，結(jié)果基本不受影響，系統(tǒng)具有較好的耐受性。

表1 系統(tǒng)耐受性考察結(jié)果

2.3 色譜行為

經(jīng)試驗(yàn)探索，綜合考慮硫氰酸根保留時(shí)間及峰分離度等因素，最終選用1.3.1的色譜條件，實(shí)現(xiàn)液體乳中硫氰酸根的準(zhǔn)確定量。硫氰酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液、陰性試樣溶液及陰性加標(biāo)試樣溶液色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，該方法選擇性高，分離效果好，加標(biāo)試樣出峰良好。

圖1 硫氰酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）、陰性試樣（B）及陰性加標(biāo)試樣（C）色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系、方法檢出限和定量限考察

取硫氰酸根系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.3.1中色譜條件進(jìn)樣，以硫氰酸根峰面積對(duì)質(zhì)量濃度計(jì)算線性回歸方程，確定相關(guān)系數(shù)。比較硫氰酸根色譜信號(hào)峰與基線信號(hào)，確定儀器最低檢出限（S/N=3），按試樣制備過(guò)程，得出方法檢出限與定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，硫氰酸根在0.0～1.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9），且該方法檢出限低（0.069 μg/g），能完全滿足分析檢測(cè)要求。

表2 硫氰酸根的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、最低檢出限、定量限

2.4.2 方法精密度考察

取0.1 μg/mL硫氰酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD），結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，硫氰酸根的保留時(shí)間和峰面積SRSD分別為0.23%和0.74%，表明其精密度較好。

表3 方法精密度試驗(yàn)（n=6）

2.4.3 穩(wěn)定性考察

取制備好的液體乳供試品溶液，按1.3.1的色譜條件每間隔4 h進(jìn)樣1次，測(cè)定硫氰酸根質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，穩(wěn)定性試驗(yàn)SRSD值為1.42%，說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=7）

2.4.4 回收率考察

分別精密稱取3份液體乳試樣，加入低（0.1 μg/mL）、中（0.2 μg/mL）、高（0.6 μg/mL）3種質(zhì)量濃度的硫氰酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述方法提取、凈化后，進(jìn)行色譜分析，對(duì)每個(gè)添加水平做3次平行試驗(yàn)，計(jì)算各組分的平均回收率及其SRSD值，以考察方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明，硫氰酸根的平均回收率在93.55%～98.06%范圍內(nèi)，SRSD值為0.89%～1.18%，方法重現(xiàn)性及準(zhǔn)確度良好，符合分析檢測(cè)要求。

表5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.5 實(shí)際試樣分析

利用試驗(yàn)所建立的方法，對(duì)市面上幾款液體乳飲品中硫氰酸根進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6所示。結(jié)果表明，該方法對(duì)這些試樣均具有良好的適用性，色譜無(wú)干擾，不同品牌液體乳飲品中硫氰酸根本底含量存在一定差異。

表6 試樣分析結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立離子色譜法測(cè)定液體乳中硫氰酸根的方法。試樣經(jīng)乙腈沉降蛋白，渦旋振搖提取，固相萃取小柱凈化，以IonPac AS19陰離子交換色譜柱分離，50～ 70 mmol/L KOH溶液梯度淋洗，抑制性電導(dǎo)檢測(cè)。該方法分離效果良好，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，精密度、準(zhǔn)確度均能滿足實(shí)際檢測(cè)工作要求，值得推廣應(yīng)用。