高組胺魚罐頭中5種生物胺含量的LC-MS分析方法

楊清華，史玉坤，戴志英，蔡秀麗，施逸嵐，張衛(wèi)兵

南通市疾病預(yù)防控制中心（南通 226002）

生物胺廣泛存在于日常生活的食品中，適量的生物胺對人體有益，但是高濃度的生物胺會對人體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用，其中組胺是毒性最強(qiáng)的生物胺，其次是尸胺和酪胺[1-3]。水產(chǎn)品是生物胺的主要研究領(lǐng)域，特別高組胺魚類[4]因組胺含量高是重點(diǎn)研究對象。高組胺魚經(jīng)常會被加工成魚罐頭而被人們喜愛。但是在魚罐頭的生產(chǎn)加工過程需要多種程序從而引起生物胺含量的變化，尤其是組胺和酪胺的變化最大，所以加強(qiáng)對高組胺魚罐頭中生物胺含量的監(jiān)測和分析對于人們的飲食健康有著重要的意義[5-8]。

目前已有多種方法應(yīng)用于生物胺的檢測，主要有紫外可見分光光度法[9]、高效液相色譜法（LC）[10-11]、氣相色譜質(zhì)譜法（GC-MS）[12]、離子色譜法[13]和液相質(zhì)譜法（LC-MS）[14-15]。LC法作為GB 5009.208—2016[16]中第一法，其定量限較高，且需要衍生化處理，步驟相對繁瑣，分析時間長，增加了檢測的不確定性因素。液質(zhì)聯(lián)用法具有靈敏度高、定性準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，逐漸被廣泛應(yīng)用，文獻(xiàn)中與該方法聯(lián)用的前處理手段主要有固相萃取、分散固相萃取以及QuEChERS提取等[17-20]，研究建立了高氯酸消解與LC-MS/MS聯(lián)用檢測魚罐頭中生物胺的方法，該方法具有操作簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好和有機(jī)試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)，可以滿足魚罐頭樣品中生物胺的定性和定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：尸胺（純度＞98%）、腐胺鹽酸鹽（純度＞99%）、酪胺鹽酸鹽（純度＞98%）、色胺（純度＞98%）、組胺鹽酸鹽（純度＞99%）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲醇（色譜純，默克）；甲酸銨（色譜級，阿拉?。?；三氯乙酸（分析純，國藥）；高氯酸（純度約為70%，國藥）；氫氧化鈉（試劑純，國藥）；魚肉粉中組胺殘留量檢測質(zhì)控樣品（CFAPA-QC056B-1，452.8±64.9 mg/kg，大連中食國實(shí)檢測技術(shù)有限公司）；甲酸（LC-MS級，F(xiàn)luka）；PTFE針式過濾器（0.22 μm，Agilent）。

1.2 儀器與設(shè)備

API 3200三重四極桿串聯(lián)液相色譜質(zhì)譜儀（AB公司，美國）；UFLCXR超快速液相色譜儀（島津，日本）；Primo R高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher公司，美國）；JY10002型電子分析天平（梅特勒，瑞士）；試驗(yàn)用水均來自Mili-Q純水系統(tǒng)（Milipore公司，美國）；Vortex1旋渦混勻儀（IKV，德國）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)和溶液的配制

分別稱取10.0 mg 5種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容至100 mL容量瓶中，制得100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液；用乙腈稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度分別為1.0，2.5，5.0，10.0，20.0，50.0和100.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；100 mL 5%高氯酸溶液是由7.1 mL高氯乙酸加92.9 mL純水配制得到的，0.5%的高氯酸是由5%高氯酸溶液十倍稀釋所得。

1.3.2 試樣制備

從江蘇、北京以及廣東不同省份采集以70份鯖魚、鰹魚、金槍魚、秋刀魚、馬鮫魚、鲅魚、青占魚、沙丁魚等高組胺魚做成的罐頭樣品，棄去油汁取可食部分的魚肉，將其切碎，用組織搗碎機(jī)搗碎將其裝入潔凈的盛樣容器，密封并做好標(biāo)記，于-20 ℃冷凍保存，盡快檢測。

1.3.3 樣品的提取凈化

稱取2 g（精確至0.01 g）粉碎的魚肉樣品于50 mL離心管中，加入15 mL 5%高氯酸溶液，均質(zhì)旋渦5 min，冰浴超聲20 min，后靜置20 min，按8 000 r/min離心10 min后將上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL容量瓶中；樣品殘?jiān)偌尤?5 mL 5%高氯酸溶液重復(fù)提取1次，合并上清液。往上述上清液中加入適量400 g/L氫氧化鈉溶液，用pH試紙調(diào)節(jié)pH至2～3，再用0.5%高氯酸溶液定容至50 mL。準(zhǔn)確移取2 mL上述溶液至離心管，加入2 mL 0.5%高氯酸溶液，加5 mL正己烷，振蕩混勻，離心，棄去正己烷層；再加入5 mL正己烷凈化，棄去正己烷層。吸取0.25 mL上述溶液于玻璃管中，加入0.75 mL乙腈，混勻過0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，對于高濃度的樣品需要逐級稀釋至線性范圍進(jìn)行檢測分析。

1.3.4 儀器條件

液相條件：色譜柱：waters Atlantis HILIC silica（3 μm，2.1 mm×100 mm）；流動相：A相為含10 mmol/L甲酸銨，0.5%甲酸的水溶液；B相為含10 mmol/L甲酸銨的0.5%甲酸的乙腈溶液；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。梯度洗脫情況見表1。

表1 流動相的梯度變化

質(zhì)譜條件：Turbo V離子源；電離方式：ESI正離子模式；定量檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；氣簾氣壓力CUS：30.0 psi；碰撞氣壓力CAS：8 psi；電噴霧電壓IS：5 500 V；去溶劑溫度：500 ℃；霧化器壓力GS1：50 psi；輔助氣壓力GS2：50 psi。碰撞室入口電壓（EP）：10.0 V；碰撞室出口電壓（CXP）：3.0 V；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），優(yōu)化后的母離子、子離子和碰撞能量見表2。

表2 5種生物胺的MRM分析條件

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

定性分析：在相同色譜條件和質(zhì)譜條件下，對著生物胺的標(biāo)準(zhǔn)品定性離子對以及出峰時間，對樣品中的生物胺進(jìn)行定性分析。

定量分析：通過生物胺定量離子的峰面積以及標(biāo)準(zhǔn)的線性回歸方程，按照式（1）計(jì)算樣品中生物胺的含量（mg/kg）。

式中：c為標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到生物胺的質(zhì)量濃度，μg/L；m為魚肉的樣量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

在電噴霧正離子方式下，對100 μg/L的生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行一極質(zhì)譜掃描（Q1），得到分子離子，即母離子；對被測物的分子離子碰撞后，進(jìn)行二極質(zhì)譜分析，得到子離子質(zhì)譜圖。通過優(yōu)化去簇電壓和碰撞氣電壓等參數(shù)，以達(dá)到最佳靈敏度。5種生物胺的MRM圖見圖1。

圖1 5種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)MRM圖譜

2.2 提取條件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑選擇

生物胺具有強(qiáng)極性及較好的水溶性，所以采用極性強(qiáng)的溶劑提取，一般使用三氯乙酸（TCA）、甲酸、乙腈、甲醇和高氯酸溶液進(jìn)行提取[20-22]，魚罐頭是一類高蛋白腌制品，提取生物胺前需要消解蛋白質(zhì)，酸解法是一種簡便快捷的蛋白質(zhì)消解方法，常用消解試劑有TCA和高氯酸；另外罐頭中含有較多的油和鹽分，因此試驗(yàn)過程中需要通過正己烷去除油脂。研究以實(shí)際檢出5種生物胺的鲅魚罐頭樣品進(jìn)行不同提取溶劑的提取效果分析，樣品分別經(jīng)5% TCA、2.5% TCA-2.5%高氯酸混合溶液和5%高氯酸溶液進(jìn)行消解提取，再經(jīng)正己烷去除脂肪凈化，三種提取溶液對提取效果的影響見圖2。結(jié)果表明，當(dāng)提取溶劑為5%三氯乙酸和2.5%三氯乙酸-2.5%高氯酸溶液時酪胺、腐胺和組胺的檢出濃度較低，所以選擇5%高氯酸對實(shí)際魚罐頭樣品中5種生物胺進(jìn)行提取。

表3 三種提取溶劑對生物胺提取效率的影響（n=3）

2.2.2 提取溶劑濃度選擇

方法使用高氯酸對魚肉進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀和生物胺提取，所以高氯酸濃度對生物胺的提取效率影響較大。該方法考察了魚罐頭樣品在不同濃度高氯酸溶液中的提取效率，結(jié)果見圖2。生物胺提取效率是以不同濃度高氯酸消解樣品后測定生物胺的含量與表2中5%高氯酸溶液提取時測得生物胺含量的比值（%）來表示。結(jié)果表明，高氯酸質(zhì)量濃度從1%到8%升高時，生物胺的提取效果變高，尤其是對于腐胺組分，隨著高氯酸濃度的增加，提取效率增加明顯，但是當(dāng)高氯酸濃度高于5%時，5種生物胺提取效率雖有所增加，但是考慮到高氯酸濃度較高，會給LC-MS/MS帶來較多損害和干擾，所以選擇5%高氯酸進(jìn)行樣品消解。

圖2 不同濃度高氯酸對5種生物胺提取效率的影響

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）指樣品處理過程中除目標(biāo)化合物外，其他組分對定量分析準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性的影響。ME采用公式（2）計(jì)算：

式中：km為基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線的斜率，k為溶劑校準(zhǔn)曲線的斜率。

參照步驟1.2.3小節(jié)處理過程提取空白魚罐頭基質(zhì)溶液，分別用乙腈和空白基質(zhì)溶液配制相同濃度的工作液，按LC-MS/MS的檢測條件進(jìn)行分析測定。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線和溶劑校準(zhǔn)曲線，并計(jì)算每種生物胺的基質(zhì)效應(yīng)，其中5種生物胺的ME值在0.86～1.0范圍內(nèi)，表明該方法的基質(zhì)效應(yīng)不明顯。因此，采用乙腈溶劑的校準(zhǔn)曲線外標(biāo)法對樣品進(jìn)行定量分析。

2.3.2 線性關(guān)系與檢出限

采用外標(biāo)法對“1.2.1小節(jié)”方法制備的1.0，2.5，5.0，10，20，50和100 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行上機(jī)檢測，以生物胺的峰面為縱坐標(biāo)，生物胺的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，5種生物胺的相關(guān)線性r均大于0.99。按照定性離子通道中信噪比（rSN）不小于3時在實(shí)際樣品中目標(biāo)化合物的濃度為檢出限，定量離子通道中信噪比（rSN）不小于10時在實(shí)際樣品中目標(biāo)化合物的濃度為定量限。該法生物胺的檢出限（rLOD）和定量限（rLQD）在0.31～4.1 mg/kg和1.0～13.6 mg/kg范圍內(nèi)。

2.3.3 質(zhì)控樣的測定

準(zhǔn)確稱取2 g魚粉質(zhì)控樣品（CFAPA-QC056B- 1），前處理同1.2.3小節(jié)，平行處理6次，取平均值，測得魚粉中組胺含量的平均值為409.2 mg/kg，在質(zhì)控樣證書質(zhì)量分?jǐn)?shù)452.8±64.9 mg/kg范圍內(nèi)，說明方法的準(zhǔn)確性良好。

2.3.4 方法的回收率和精密度

開展某鲅魚罐頭樣品的加標(biāo)和精密度試驗(yàn)，準(zhǔn)確稱取2 g粉碎的魚肉樣品，分別進(jìn)行5，50和100 mg/kg三個不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平需要獨(dú)立檢測6次，計(jì)算其加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表4。其中加標(biāo)回收率在76.0%～ 108%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.89%～5.08%范圍內(nèi)，說明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

表4 加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.4 樣品測定

分別應(yīng)用該方法對70份高組胺類魚罐頭進(jìn)行生物胺含量的檢測分析，5種生物胺的總含量在未檢出（ND）～652.9 mg/kg范圍內(nèi)，每種生物胺的含量結(jié)果見圖4。每種罐頭中單生物胺的含量大部分＜50 mg/kg，色胺的檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)在ND～56.5 mg/kg范圍內(nèi)；酪胺的檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)在ND～381.5 mg/kg范圍內(nèi)；組胺的檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)在ND～330.5 mg/kg范圍內(nèi)；尸胺的檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)在ND～198.3 mg/kg范圍內(nèi)；腐胺的檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)在ND～217.6 mg/kg范圍內(nèi)。目前尚未有針對高組胺魚罐頭中生物胺的檢測分析報(bào)道，只有研究測定部分金槍魚、沙丁魚以及鯖魚品種罐頭中組胺的含量，有報(bào)道沙丁魚罐頭中組胺含量在ND～354.05 mg/kg之間，金槍魚罐頭中組胺含量在ND～197.47 mg/kg之間；鯖魚罐頭中組胺含量在ND～64.05 mg/kg[23-24]之間。研究測定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本在相同水平范圍內(nèi)。

圖3 5種生物胺在高組胺魚罐頭樣品中的結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3 討論與結(jié)論

研究優(yōu)化了提取試劑種類和濃度對魚罐頭樣品中生物胺提取效果的影響，建立了5種生物胺的高氯酸消解與LC-MS/MS聯(lián)用的檢測方法，檢出限和定量限分別0.31～4.1 mg/kg和1.0～13.6 mg/kg之間，5種生物胺化合物的回收率在76.0%～108%之間，方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏、分析時間短，完全滿足對魚罐頭樣品中多種生物胺的同時檢測分析。

將所建方法應(yīng)用于70份不同品種高組胺魚罐頭中生物胺含量的檢測分析，經(jīng)檢測驗(yàn)證，完全能滿足檢測需求，該方法的組胺檢測結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的高組胺魚罐頭中組胺含量相近。方法在定性和靈敏度方面明顯優(yōu)于國標(biāo)方法，克服了分光光度法和液相色譜法檢測過程繁瑣、準(zhǔn)確度差、檢出限高等缺點(diǎn)，既簡化了前處理步驟，又在保證準(zhǔn)確度的前提下，減少了大量有毒溶劑的使用，適用于魚罐頭中生物胺的定性和定量分析。