UPLC-MS/MS測定燕窩中18種氨基酸

白偉娟，張小江，柳訓(xùn)才，張曉婷，范群艷，林素瓊

廈門市燕之屋絲濃食品有限公司（廈門 361100）

燕窩是由金絲燕屬（Aerodramus）和侏金絲燕屬（Collocalia）金絲燕的唾液與其絨羽筑成的巢穴的天然食品[1]，燕窩大多產(chǎn)于泰國、印度尼西亞和馬來西亞等東南亞一帶，因其產(chǎn)量少、味道鮮美，具有“東方魚子醬”之稱，是被受歡迎藥食同源的高級保健食品。據(jù)文獻(xiàn)記載，關(guān)于燕窩療效最早見于清代王昂所著作《本草備要》，關(guān)于療效詳細(xì)記載主要是趙學(xué)敏在《本草綱目拾遺》書中記載：“燕窩，味甘淡平，大養(yǎng)肺陰，化痰止咳，補(bǔ)而能清，為調(diào)理虛損勞積之圣藥[2]”。現(xiàn)代研究結(jié)果表明燕窩具有抗流感病毒和抑制性血凝[3-4]、提高智力和記憶力[5-6]、抗氧化[7]、抗衰老[8]等功能。因此，燕窩在中國長期以來備受追捧。

燕窩作為一種藥食同源的高端滋補(bǔ)品，深受消費(fèi)者的喜愛，但因其產(chǎn)量小、供不應(yīng)求、工序繁瑣等原因，導(dǎo)致燕窩價格高。為牟取更多利益，不良商家在燕窩中摻假造假、以次充好，使燕窩質(zhì)量參差不齊，給市場和消費(fèi)者造成困擾。由于氨基酸是組成蛋白的基本單位，對氨基酸檢測方法有熒光光譜法[9]、分光光度發(fā)[10-11]、毛細(xì)電泳法[12]、近紅外光譜法[13-14]、化學(xué)發(fā)光法[15]、高效液相色譜法[16-19]、氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法[20]、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法[21-22]、氨基酸自動分析儀[23-24]等。燕窩中氨基酸檢測多數(shù)采用氨基酸自動分析儀[25-28]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS/MS）具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)及同時檢測多組分等優(yōu)點，但其易受樣品基質(zhì)影響。試驗主要利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立燕窩中18種氨基酸檢測方法，旨在為燕窩質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

燕窩（廈門市燕之屋絲濃食品有限公司）。

甲酸、甲醇（色譜純，美國天地）；17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司）；色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（美國Sigma）；鹽酸、氫氧化鈉（優(yōu)級純，國藥集團(tuán)）；苯酚（分析純，西隴科學(xué)）。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（LCMS 8050，島津）；凍干機(jī)（Alpha 2-4 LSC plus，德國Christ）；電子天平（BSA224S，Sartorius）；全自動氮吹濃縮儀（Auto EVA-20Plus，睿科）；恒溫箱（DIN 12880，德國賓得）。

1.2 樣品前處理

1.2.1 17種氨基酸樣品前處理

稱取20～40 mg（精確至0.000 1 g）粉碎均勻的燕窩置于安瓿瓶中，在安瓿瓶中加入5 mL 6 mol/L鹽酸溶液，繼續(xù)向安瓿瓶中加入1滴0.1%苯酚混勻，將安瓿瓶放入全自動氮吹濃縮儀中，充入氮?dú)? min，在充氮?dú)鉅顟B(tài)下封口。將已封口的安瓿瓶放在110 ℃的恒溫箱內(nèi)，水解22 h后，取出，冷卻至室溫。打開安瓿瓶，將水解液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用少量水多次沖洗安瓿瓶，水洗液移入同一容量瓶中，用水定容至刻度，振蕩混勻，靜置。準(zhǔn)確移取1.00 mL稀釋液移入試管中，置于-40 ℃冷凍冰箱中預(yù)凍4 h，將結(jié)冰的稀釋液放入凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥。待干燥完成，用水進(jìn)行溶解，定容至25 mL容量瓶，在10 000 r/min下離心10 min，上清液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣，檢測甲硫氨酸，再進(jìn)行稀釋10倍，同上稀釋液離心，檢測其他16種氨基酸。

1.2.2 色氨酸樣品前處理

稱取20～40 mg（精確至0.000 1 g）粉碎均勻的燕窩置于安瓿瓶中，在安瓿瓶中加入4 mL 5 mol/L氫氧化鈉溶液。繼續(xù)向安瓿瓶中加入1滴0.1%苯酚混勻，然后將安瓿瓶放入全自動氮吹濃縮儀中，充入氮?dú)? min，在充氮?dú)鉅顟B(tài)下封口。將已封口的安瓿瓶放在110 ℃的恒溫箱內(nèi)，水解22 h后，取出，冷卻至室溫。打開安瓿瓶，將水解液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用少量水多次沖洗安瓿瓶，水洗液移入同一容量瓶中，用水定容至刻度，振蕩混勻，靜置。準(zhǔn)確移取1.00 mL稀釋液用水定容至25 mL并用甲酸調(diào)pH至中性，用0.22 μm濾膜過濾后，過濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣，檢測色氨酸。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1 液相色譜條件

色譜柱為島津C18-AQ，2.1 mm×100 mm，1.9 μm；流速300 μL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL；分析時間16 min；流動相A為0.05%甲酸溶液，流動相B為甲醇；洗脫程序見表1。

表1 洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子化電離源ESI。監(jiān)測方式：正離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。接口電壓2.5 kV；霧化氣流量3 L/min；加熱氣流量10 L/min；接口溫度300 ℃；DL溫度250 ℃；加熱塊溫度400 ℃；干燥氣流量10 L/min；CID氣270 kPa。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

1.4.1 17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

準(zhǔn)確移取0，0.125，0.250，0.500，1.000，1.500，2.000，2.500和3.000 mL 17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作液至10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，配成濃度范圍分別為賴氨酸5.00～120 mg/L、胱氨酸5.16～123 mg/L、天冬氨酸10.0～240 mg/L、甘氨酸10.0～240 mg/mL、組氨酸4.00～96.4 mg/L、精氨酸11.0～263 mg/L、丙氨酸7.95～190 g/mL、絲氨酸8.17～196 mg/L、蘇氨酸6.64～159 mg/L、谷氨酸7.82～187 mg/L、脯氨酸5.44～ 130 mg/L、纈氨酸6.35～152 mg/L、甲硫氨酸4.41～105 mg/L、亮氨酸5.26～126 mg/L、異亮氨酸5.82～139 mg/L、酪氨酸6.09～146 mg/L、苯丙氨酸6.85～164 mg/L的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

1.4.2 色氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

準(zhǔn)確移取0，0.100，0.200，0.500，1.00，1.50和2.00 mL色氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液至10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，配成質(zhì)量濃度范圍為10.00～200 ng/mL的色氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍及相關(guān)系數(shù)

標(biāo)曲配制見1.4小節(jié)。利用氨基酸的峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，以苯丙氨酸為例，線性回歸方程見圖1，其線性相關(guān)系數(shù)大于0.999，其余結(jié)果見表3。由表3可見，所有18種氨基酸均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。采用標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋的方法確定儀器的檢出限（SLOD）和定量限（SLOQ），分別以信噪比rSN≥3和rSN≥10時對應(yīng)目標(biāo)物濃度作為儀器檢出限和定量限，具體結(jié)果見表3。

圖1 苯丙氨酸濃度與峰面積曲線圖

2.2 方法的精密度

因為燕窩中氨基酸含量高，所以采用不同的取樣量考察其準(zhǔn)確度，以梯度取樣量20，30和40 mg分別進(jìn)行6平行精密度試驗，計算精密度，SRSD在0.85%～ 4.98%之間，具體結(jié)果見表4。

表4 18種氨基酸的精密度（n=6）

接表4

2.3 燕窩中氨基酸的分析研究

圖3 燕窩中17種的分離色譜圖

對燕窩樣品進(jìn)行酸水解和堿性水解，通過LCMS/MS對天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸和胱氨酸17種氨基酸和色氨酸進(jìn)行檢測（見圖2～圖4）。

圖2 18種氨基酸混標(biāo)的分離色譜圖

圖4 燕窩中色氨酸的分離色譜圖

利用LC-MS/MS對鹽酸水解和堿性水解的30批燕窩樣品進(jìn)行分析比較，并對其獲得結(jié)果進(jìn)行整理。由表5和表6可以看出，30批燕窩均含有18種氨基酸，其中包含8種必需氨基酸。計算出18種氨基酸總含量、必需氨基酸占總氨基酸的比值、各種氨基酸含量占總氨基酸的比值及比值范圍。結(jié)果表明：燕窩的總氨基酸含量在59.10～68.73 g/100 g之間；必需氨基酸含量在20.91～25.57 g/100 g之間，必需氨基酸占總氨基酸比例35.3%～39.60%；在氨基酸組成中，胱氨酸含量最高，占總量的10%～14%，甲硫氨酸含量最低，占總量0.5%～0.7%，其他氨基酸的含量均在2%～9%之間。30批燕窩18種氨基酸含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.77%～ 14.83%之間，說明各個批次間燕窩中氨基酸成分組成均存在較大變異[26]。

3 結(jié)論

30批燕窩中總氨基酸含量在59.10～68.73 g/100 g之間，必需氨基酸含量在20.91～25.57 g/100 g之間，必需氨基酸占總氨基酸比例35.3%～39.60%。各個批次燕窩中氨基酸含量存在一定程度的差異，主要原因可能是燕窩中水分差異、金絲燕品種、成熟度、生活環(huán)境等。30批燕窩中氨基酸組成比例相近，均檢出18種氨基酸（天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸），燕窩中氨基酸含量豐富，且氨基酸對人體的新陳代謝具有一定作用。