高效液相色譜法用于黃體酮注射液的含量測(cè)定*

黃孟秋，盧瑞芯，黃澤丹，王涌杰，陳紅英

(廣州白云山明興制藥有限公司，廣東 廣州 510250)

黃體酮(Progesterone，又稱孕酮)，由孕二醇在黃體生成激素作用下轉(zhuǎn)化成，是臨床常用的孕激素類藥物，已被廣泛應(yīng)用于各種婦科疾病。黃體酮的荷爾蒙作用是在1929年被發(fā)現(xiàn)的，1934年Willard Allen分離出純凈結(jié)晶的黃體酮，并與哥倫比亞大學(xué)的Wintersteiner在實(shí)驗(yàn)室共同測(cè)定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)，將其命名為Progesterone。同年下半年，黃體酮實(shí)現(xiàn)了的化學(xué)合成，開(kāi)始被用于臨床研究。目前臨床上常用的黃體酮制劑主要有口服、注射和陰道給藥三種給藥途徑，肌內(nèi)注射是最普遍的形式[1-2]。用于肌內(nèi)注射的黃體酮注射液的適應(yīng)癥為，用于月經(jīng)失調(diào)，如閉經(jīng)和功能性子宮出血、黃體功能不足、先兆流產(chǎn)和習(xí)慣性流產(chǎn)(因黃體不足引起者)、經(jīng)前期緊張綜合癥的治療[3-4]。《中國(guó)藥典》2020年版中黃體酮注射液含量測(cè)定的前處理環(huán)節(jié)復(fù)雜，采用了提取、復(fù)溶、離心等方法，整個(gè)過(guò)程操作繁瑣，影響因素較多，尤其是該方法需要將乙醚提取液置具塞離心管中，在溫水浴中使乙醚揮散，因乙醚的沸點(diǎn)僅為 34.6 ℃，置離心管中揮發(fā)，有爆沸的可能，容易發(fā)生意外導(dǎo)致火災(zāi)，實(shí)際操作中對(duì)操作人員而言有較大的風(fēng)險(xiǎn)[5]。結(jié)合文獻(xiàn)[6-8]，本研究改進(jìn)了黃體酮注射液含量測(cè)定中供試品的前處理方法，大幅簡(jiǎn)化了藥典方法中復(fù)雜的前處理環(huán)節(jié)，更適用于黃體酮注射液的含量測(cè)定。

圖1 黃體酮化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of progesterone

1 儀器與材料

1.1 儀 器

LC-2030 PLUS高效液相色譜儀；梅特勒托利多XS105電子天平；天津市泰斯特儀器有限公司DK-98-II電熱恒溫水浴鍋；AXTG16G高速離心機(jī)。

1.2 試 藥

乙腈(色譜純，批號(hào)：2020AH006)，康科德；甲醇(色譜純，批號(hào)：2020MH008)，康科德；水為實(shí)驗(yàn)室制備超純水；黃體酮對(duì)照品(批號(hào)：100027-201810，含量：99.6%)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；黃體酮注射液(規(guī)格：1 mL:10 mg，共10個(gè)批次)，實(shí)驗(yàn)室自制;精制芝麻油(批號(hào)：19C3607，SIO，注射級(jí))。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(4.6 mm×150 mm，5 μm色譜柱)；流動(dòng)相：水-乙腈(50∶50)等度洗脫；流速：1.5 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：241 nm；柱溫：30 ℃；溶劑為甲醇，進(jìn)樣前溶液均用0.45 μm孔徑尼龍濾膜過(guò)濾。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取黃體酮對(duì)照品約20 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即為黃體酮儲(chǔ)備液 (0.40 mg/mL)。分別精密量取黃體酮儲(chǔ)備液2 mL、4 mL、 5 mL、6 mL、7 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制備得到黃體酮濃度約為16、32、40、48、56 μg/mL的對(duì)照品溶液。其中40 μg/mL濃度的對(duì)照品溶液作為含量測(cè)定用的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液及陰性對(duì)照溶液的制備

精密量取本品2 mL(約相當(dāng)于黃體酮20 mg)，置50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，再精密量取供試品溶液5 mL，至50 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取精制芝麻油2 mL，按上述方法操作，即得陰性對(duì)照溶液。

2.4 專屬性試驗(yàn)和系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別對(duì)陰性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行分析，考察樣品中輔料對(duì)黃體酮定量的干擾，根據(jù)圖2所示，樣品中輔料不干擾黃體酮的測(cè)定。理論塔板數(shù)按黃體酮計(jì)算不低于4000。

圖2 專屬性試驗(yàn)色譜圖Fig.2 Specificity test chromatogram

2.5 線性范圍

對(duì)“2.2”項(xiàng)不同濃度的對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到黃體酮的線性方程為Y=23372030.79X-81485.62，線性相關(guān)系數(shù)(r)為0.9998，線性范圍16.05～55.98 μg/mL，說(shuō)明方法在該范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，符合規(guī)定。

圖3 線性結(jié)果Fig.3 Linearity results

2.6 精密度試驗(yàn)

2.6.1 重復(fù)性試驗(yàn)

采用批號(hào)為20200717的黃體酮注射液作為供試品，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣分析，計(jì)算得到黃體酮含量的RSD(n=6)為0.85%，說(shuō)明方法的重復(fù)性良好。

2.6.2 中間精密度試驗(yàn)

照2.6.1重復(fù)性試驗(yàn)方法于不同日期、不同儀器，由不同操作人員，對(duì)同一批樣品進(jìn)行含量測(cè)定，重復(fù)操作6次。6次含量結(jié)果的RSD為0.52%，小于2.0%；12次含量結(jié)果的RSD為1.03%，小于2.0%，符合要求。

2.7 準(zhǔn)確度

分別精密稱取黃體酮對(duì)照品各約8 mg、10 mg、12 mg，置不同25 mL量瓶中，按照處方量精密加入芝麻油約0.907 g(相當(dāng)于芝麻油1 mL)，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別作為80%、100%、120%加標(biāo)供試品溶液。同法配制三份，共九份樣品，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示，黃體酮的平均加樣回收率為 100.2%(n=9)，RSD為0.79%(n=9)，表明方法的加樣回收率良好。

表1 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Accuracy test results

2.8 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液及供試品溶液于室溫避光條件下放置，于 0～48 h，分別精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察其溶液穩(wěn)定性。溶液如在初步擬定的時(shí)間或條件內(nèi)不穩(wěn)定，可縮短考察時(shí)間及改變放置條件。

表2 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Solution stability test results

對(duì)照品溶液中，在48 h內(nèi)的主峰面積變化率最大為1.38%，小于2.0%，即對(duì)照品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定；供試品溶液中，在24 h內(nèi)的主峰面積變化率最大為1.45%，小于2.0%，即供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，在48 h內(nèi)的主峰面積變化率最大為2.02%大于2.0%，即供試品溶液在48小時(shí)內(nèi)不穩(wěn)定。

2.9 樣品含量測(cè)定

表3 十個(gè)批次黃體酮注射液含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Ten batches of progesterone injection content determination results

采用本研究建立的含量測(cè)定方法及2020版中國(guó)藥典的方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)室制備得到的十個(gè)批次的黃體酮注射液進(jìn)行含量測(cè)定，每個(gè)樣品制備供試品溶液2份，含量測(cè)定的結(jié)果取平均值，測(cè)定結(jié)果顯示該方法與藥典方法含量測(cè)定結(jié)果一致，說(shuō)明方法準(zhǔn)確可靠，用于黃體酮注射液的含量測(cè)定具備可行性。結(jié)果如表3所示。

3 結(jié) 論

3.1 提取過(guò)程更簡(jiǎn)便

藥典方法選擇乙醚作為提取溶劑，需要將乙醚水浴揮散后甲醇復(fù)溶提取物，并需要通過(guò)多次振搖后離心的方式去除溶解在乙醚而不溶于甲醇的輔料成分，操作相對(duì)繁瑣；本實(shí)驗(yàn)采用甲醇溶解黃體酮，操作簡(jiǎn)單，盡可能減少操作中引入的誤差及減少輔料中的成分對(duì)黃體酮含量測(cè)定時(shí)的干擾。

3.2 檢驗(yàn)過(guò)程更安全

避免乙醚提取液置離心管中揮發(fā)，降低試驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)，避免因意外導(dǎo)致火災(zāi)，實(shí)際操作中對(duì)操作人員而言更安全。

3.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程更快捷

藥典方法需要用甲醇振搖4次(5、5、5、3 mL)復(fù)溶黃體酮乙醚提取物，每次需振搖10 min，之后還需離心15 min，處理一份樣品共計(jì)100 min。本實(shí)驗(yàn)處理一份樣品僅需5 min，相對(duì)而言處理過(guò)程更快捷。

3.4 含量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠

本實(shí)驗(yàn)在保證檢測(cè)波長(zhǎng)241 nm與藥典方法一致的前提下，對(duì)供試品前處理方法加以優(yōu)化，結(jié)果顯示該方法與藥典方法含量測(cè)定結(jié)果一致，說(shuō)明方法準(zhǔn)確可靠，可用于黃體酮注射液的含量測(cè)定。