生草對關中地區有機獼猴桃園土壤養分及細菌群落的影響

靳旭妹，王瑩瑩，劉崇義，陳新義，龍明秀，何樹斌

（西北農林科技大學草業與草原學院，陜西楊凌 712100）

有機農業（organic agriculture）是指遵循自然規律和生態學原理，協調種植業和養殖業的平衡，在生產中不采用基因工程獲得的生物及其產物，不使用化學合成的農藥、化肥、生長調節劑、飼料添加劑等，采用一系列可持續發展的農業技術以維持持續穩定的農業生產體系的一種農業生產方式［1］。有機農業是生態友好型農業［2］，其為應對目前農業發展面臨的諸多問題提供了有效途徑，得到了國家的積極推廣［3］。

近年來，我國獼猴桃（Actinidia chinensis）栽培面積和產量均位居世界第一位，而陜西省是我國乃至世界獼猴桃最大的產區［4-5］。近年來，陜西獼猴桃施肥不增產的情況普遍存在，極大挫傷了果農種植的積極性［6］。果園傳統的清耕管理方式勞動強度大，土壤保水、保肥能力低，肥料投入成本高，而且造成冬春季節土壤裸露［7］。因此，需要施加合理的果園土壤管理模式，促進獼猴桃種植業增產增收。

果園生草是指對果園實施全園或行間生草覆蓋，是一種先進果園土壤耕作管理模式，能促進果品的優質可持續生產。我國引入果園生草措施已近40年，對生草果園小氣候、土壤的物理、化學和生物學特性，以及果實產量和品質的變化等開展了較多研究［8-9］。與清耕模式相比，果園生草有利于構建良好的果園生產體系、改善果園環境、提高果園生產力［10-11］。目前，該模式已在蘋果（Malus domestica）園［12-13］、柑橘（Citrus reticulata）園［14］、葡萄（Vitis vinifera）園［15］等果園中得到應用。研究表明，生草可提高土壤有機質［16］、酶活性［17-18］，增加土壤微生物群落多樣性［19-20］。同時，果園生草可有效控制雜草生長［21］、降低生產成本，提高果園產出［22-23］，是實現果樹產業提質增效及農業可持續發展的有效途徑之一［8］。果園生草栽培有人工生草和自然生草兩種模式，自然生草可以改善土壤理化性狀，增加碳、氮含量［24］，但是自然生草生長旺盛，容易與果樹爭水爭肥［25］，且存在惡性雜草，因此有必要選擇適宜關中地區獼猴桃園的草種進行人工生草，人工生草宜選擇覆蓋率較高的草種［26-27］。因此，本研究針對關中地區有機獼猴桃園在果實采摘后土壤處于空閑、有害雜草較多等現狀，遵循有機果園的發展理念，評估不同草種在關中地區有機獼猴桃園越冬率、生長情況，并測定不同生草處理對果園耕層土壤含水量、pH、有機質、微生物碳氮、酶活性及土壤細菌群落結構的影響差異，篩選出適宜關中地區有機獼猴桃園種植的草種或組合，為關中地區有機獼猴桃園生產提供理論依據及技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

本試驗基地位于陜西省楊凌示范區五泉鎮上灣村百恒有機獼猴桃園（34°14′-34°20′N，107°59′-108°08′E），海拔為540.1 m，氣候溫和（東亞暖溫帶半濕潤半干旱氣候），年均氣溫12.9℃，年均降水量635.1 mm。該獼猴桃園果樹為8年生的“翠香”品種，按“T”形架栽培，株行距6.0 m×3.8 m。該果園自然生草處理的秋季雜草群落為阿拉伯婆婆納（Veronica persica）、齒果酸模（Rumex dentatus）、薺菜（Capsella bursa-pastoris）、打碗花（Calystegia hederacea）、豬殃殃（Galium aparine）和花葉滇苦菜（Sonchus asper）等。

1.2 試驗材料

供試生草草種為多年生黑麥草（Lolium perenne）、毛苕子（Vicia villosa）、草木樨（Melilotus officinalis）、白三葉（Trifolium repens）和鼠茅草（Vulpia myuros）。

1.3 試驗方法

1.3.1試驗設計 本研究于2020年9月開始播種試驗，試驗設3種豆禾混播，多年生黑麥草+毛苕子混播（Mode 1）、多年生黑麥草+草木樨混播（Mode 2）、多年生黑麥草+白三葉混播（Mode 3）及禾本科鼠茅草單播（Mode 4），以自然生草為對照（CK），每個處理重復3次，共15個處理。采用隨機區組設計，每小區面積為12.0 m×4.4 m。播種量為：多年生黑麥草22.5 kg·hm-2，毛苕子75.0 kg·hm-2，草木樨15.0 kg·hm-2，白三葉80.0 kg·hm-2，鼠茅草30.0 kg·hm-2。獼猴桃園行間翻耕耙平后播種，綠肥在獼猴桃園行間撒播。為避免草種與果樹出現爭水爭肥，生草區與果樹根部保持0.8 m的緩沖區。于出苗期進行雜草調查后，通過人工拔除雜草一次，此后至試驗采樣，未對試驗地塊進行施肥和除草，正常噴灌。

1.3.2樣品采集及測定 2021年5月25日，于牧草盛花期按每小區“S”型5點鉆取土芯5個（2.5 cm×20.0 cm），充分混合作為1個土樣，去除植物根系與其他雜質后均勻混合，經2 mm土篩后分為2份，1份樣品風干，用于測定土壤的理化性質；第2份樣品保存于-80℃冰箱，及時送樣測序。

1.4 測定指標和方法

1.4.1地上植物特征調查 雜草調查：于苗期雜草最旺盛的時期取1 m2樣方調查雜草種類及數量。

越冬率：于越冬前（2020年12月1日）、返青后（2021年3月1日），在田間小區內劃分固定的小區數計，越冬率（%）=越冬后苗數/調查總苗數×100%。

地上部生物量：于盛花期按照小區取1 m2樣點，割取地上部稱鮮重（g）。

1.4.2土壤理化性質測定 用內徑40 mm土鉆分別取5、10、15、20 cm處的土壤，采用烘干法測定土壤含水量（%）。采用電極電位法測定土壤pH值（1.0:2.5土水比浸提液）。采用重鉻酸鉀-濃硫酸外加熱法測定有機質［28］。采用氯仿熏蒸直接浸提法測定微生物碳［29］，采用流動分析儀法測定微生物氮［30］。

1.4.3土壤酶活性測定 用苯酚鈉比色法測定脲酶（urease）活性，用磷酸苯二鈉比色法測定堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）活性，用3，5-二硝基水楊酸比色法測定蔗糖酶（sucrase）活性，采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶（catalase）活性［31］。

1.4.4土壤細菌多樣性測序 采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒提取細菌總DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，同時采用紫外分光光度計（NanoDrop，Wilmington，DE，美國）對DNA進行定量。對16S rDNA（V3+V4）可變區進行PCR擴增，使用的引物為341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）［32］。PCR產 物 由AMPure XT beads（Beckman Coulter Genomics，Danvers，MA，美國）純化，Qubit（Invitrogen，美國）定量。擴增子池用于測序，擴增子文庫的大小和數量分別在Agilent 2100生物分析儀（Agilent，美國）和Illumina（Kapa Biosciences，Woburn，MA，美國）的文庫定量試劑盒上進行評估。在NovaSeq 6000平臺上對庫進行排序。

1.5 數據分析

用Microsoft Excel 2016進行數據初步整理，用SPSS 26軟件進行單因素方差分析和顯著性檢驗，顯著性水平為α=0.05，用GraphPad Prism 8作圖。Alpha多樣性和Beta多樣性均使用QIIME2計算，使用R（v3.5.2）作圖，物種注釋采用QIIME2的插件feature-classifier進行序列比對，比對數據庫為SILVA和NT-16S數據庫，以SILVA數據庫注釋結果為準。通過線性判別分析效應大小方法（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析不同生草處理之間具有顯著差異的物種，使用R語言vegan包進行非度量多維尺度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS）、細菌優勢門和土壤環境因子冗余分析（redundancy analysis，RDA），采用R語言pheatmap包進行熱圖分析。

2 結果與分析

2.1 地上植物特征調查

2.1.1不同生草草種的越冬率比較 由圖1可知，5個供試草種中鼠茅草越冬率最高，為93.45%，其次為白三葉、多年生黑麥草、毛苕子、草木樨，分別為84.65%、79.41%、59.37%、56.53%。

2.1.2不同生草處理雜草發生情況和地上部生物量比較 由表1可知，4個人工生草處理對獼猴桃果園雜草數量均有顯著抑制效果（P＜0.05），其中Mode 2雜草株數最多，其次為Mode 3、Mode 1和Mode 4。人工生草處理地上部鮮草產量差異顯著（P＜0.05），Mode 1地上部 鮮 草 產 量 最 大，為1107.41 g·m-2，較Mode 4（885.18 g·m-2）高25.11%，較Mode 2（705.57 g·m-2）高56.95%，較Mode 3（690.74 g·m-2）高60.33%。

表1 不同生草處理雜草發生情況和地上部鮮草產量Table 1 Weed occurrence and aboveground fresh yield of different cover crops treatments

2.2 不同生草處理對土壤環境因子的影響

2.2.1不同生草處理對土壤含水量的影響 由表2可知，在0～20 cm土層，4個人工生草處理下土壤含水量較CK均增加，但未表現出顯著性差異。在0～5 cm、10～15 cm土層，Mode 1土壤含水量均最高，較CK分別增加22.44%、6.60%；在5～10 cm、15～20 cm土層，Mode 4土壤含水量均最高，較CK分別增加

表2 不同生草處理對0～20 cm土層土壤含水量的影響Table 2 Effect of different cover crops treatments on soil water content at a depth of 0-20 cm（%）

9.55%、43.98%。

2.2.2不同生草處理對土壤養分與酶活性的影響由表3可知，Mode 4較其他處理降低了獼猴桃果園的土壤pH，但未表現出顯著性差異；4個人工生草處理下有機質含量較CK均增加，除Mode 2未達到顯著水平，其他處理均達顯著水平（P＜0.05），其中增幅最大的是Mode 1，有機質含量較CK增加38.63%，其次為Mode 4、Mode 3，分別增加23.24%、11.23%。另外，Mode 1較其他處理提高土壤微生物碳、氮含量的效果最明顯，與CK相比，土壤微生物碳、氮含量分別提高了25.73%、36.25%，而Mode 3、Mode 4土壤微生物碳含量有降低趨勢，與CK相比，分別降低了6.09%、5.63%。4個人工生草處理較CK均能提高果園土壤脲酶、堿性磷酸酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性，其中，Mode 1提高土壤脲酶、蔗糖酶活性最為顯著（P＜0.05），分別為39.83%、60.79%；Mode 1、Mode 4提高土壤堿性磷酸酶活性的效果顯著（P＜0.05），較CK分別提高了20.56%、14.63%。Mode 2、Mode 3較CK土壤堿性磷酸酶活性提高，但未達到顯著水平；Mode 2、Mode 4提高土壤過氧化氫酶活性的效果顯著（P＜0.05），較CK分別提高了16.70%、16.10%。

表3 不同生草處理對土壤養分與酶活性的影響Table 3 Effects of different cover crops treatments on soil chemical and biological characteristics

2.3 不同生草處理對土壤細菌多樣性指數的影響

基于物種豐富度分析Alpha多樣性，其Chao1指數和特征序列數主要是估計群落中包含物種的數目；Goods_coverage是指微生物覆蓋率，其數值越高，則樣本中新物種沒有被測出的概率越低；Shannon指數來源于信息熵，Shannon指數越大，表示不確定性大，不確定性越大，表示這個群落中未知的因素越多，也就是多樣性高。5個生草處理下土壤細菌Alpha多樣性指數無顯著差異，5組中的Goods_coverage均在99%左右，說明對土壤細菌微生物具有較高的覆蓋度，可較為全面地揭示土壤樣品的微生物組成。5個處理下Mode 3土壤細菌物種豐富度最高，Chao1和特征序列數分別為3040.59和2787.67，土壤細菌Shannon指數為Mode 1＞Mode 2=Mode 3＞CK=Mode 4（表4）。

表4 不同生草處理對土壤細菌Alpha多樣性的影響Table 4 Effect of different cover crops treatments on Alpha diversity of soil bacteria

2.4 不同生草處理對土壤細菌多樣性的影響

5個處理下土壤細菌群Feature分布特征如圖2所示，5個處理共有的Feature數目為1338個，CK、Mode 1、Mode 2、Mode 3、Mode 4特有的Feature數目分別為2774、3624、3110、3648和3202。對5個處理的土壤細菌群落進行NMDS分析，結果表明（圖3），5個處理土壤細菌群落分布較為集中，且各處理間未明顯分開，表明5個處理土壤細菌群落結構無明顯差異。

根據所有樣本16S rDNA在門水平上的豐度信息（圖4），5個處理土壤共有優勢細菌群落從高到低分別為：變形菌門（Proteobacteria，25.40%～32.19%）、酸桿菌門（Acidobacteria，19.69%～25.90%）、浮霉菌門（Planctomycetes，8.76%～17.03%）、放 線 菌 門（Actinobacteria，7.68%～11.12%）、芽 單 胞 菌 門（Gemmatimonadetes，5.00%～6.95%）、綠彎菌門（Chloroflexi，4.50%～6.15%）、疣微菌門（Verrucomicrobia，2.20%～5.09%）、羅庫菌門（Rokubacteria，2.78%～3.82%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，1.86%～4.26%）、匿桿菌門（Latescibacteria，1.81%～2.45%）。可以看出，Mode 1變形菌門相對豐度最高（32.19%），Mode 4酸桿菌門相對豐度最高（25.90%），Mode 2浮霉菌門、放線菌門、芽單胞菌門和綠彎菌門相對豐度較高（17.03%、11.12%、6.95%和6.15%），Mode 3疣微菌門、羅庫菌門、擬桿菌門和匿桿菌門相對豐度較高（5.09%、3.82%、4.26%和2.45%）。

2.5 不同生草處理土壤細菌群落結構的LEfSe差異分析

采用線性判別分析效應大小方法（LEfSe）對不同類群中的主要細菌進行了定量分析，進一步闡明了土壤樣品中鑒定出的細菌分支之間可能存在的相互作用。由圖5可知，5個不同生草處理使獼猴桃園土壤細菌群落產生明顯差異，共有10個細菌分支表現出顯著差異，其中Mode 1存在6個差異顯著的細菌分支，Mode 2存在3個差異顯著的細菌分支，Mode 4存在1個差異顯著的細菌分支。

2.6 細菌群落與土壤環境因子的響應關系

為進一步探究人工生草和自然生草的獼猴桃園土壤微生物群落變化的影響機制，以及確定能夠引起這種變化所要改變的首要土壤環境因子，揭示生草-土壤-微生物間的相互作用關系，以土壤養分和酶活性為解釋變量，微生物群落為響應變量，在門水平上對土壤細菌群落結構與環境因子進行冗余分析（redundancy analysis，RDA）。圖6a顯示了門水平相對豐度前十的物種與土壤環境因子之間的關系，RDA 1和RDA 2分別解釋了總變化量的18.73%和11.17%，其中，pH、Cat對細菌群落結構影響較大。相關系數熱力圖（correlation coefficient heat map）能夠直觀地展現出不同土壤環境因子與細菌群落的相關性。由圖6b可知，細菌群落結構門分類水平中芽單胞菌門與堿性磷酸酶（Alp）呈顯著負相關關系（P＜0.05），綠彎菌門與pH顯著正相關（P＜0.05），羅庫菌門與微生物碳（MBC）呈顯著負相關關系（P＜0.05）。

3 討論

3.1 不同生草處理田間表現差異

本研究中，人工生草可有效控制果園雜草數量，以鼠茅草效果最佳。對草種越冬率、4個人工生草處理的地上部生物量進行比較，結果表明：鼠茅草適應性強、耐寒，其越冬成活率高于其他幾個草種，達93.45%。人工生草的4個處理中多年生黑麥草+毛苕子地上部鮮草產量最高，達1107.41 g·m-2，可向土壤提供更多的凋落物，為土壤微生物分解提供豐富的食物源［33］。

3.2 不同生草處理對土壤環境因子的影響

在一定的土壤含水量范圍內，土壤呼吸速率隨土壤水分的增加而增加［34-35］。本研究中，4個人工生草處理均可提高土壤含水量，這可能是由于綠肥生長迅速、莖葉茂盛、對地表遮蔽度高，可以明顯地抑制根際表土水分的蒸發［36］。土壤有機質累積程度是土壤肥力的重要特征，是影響土壤物理性狀、供肥保肥和養分有效性的關鍵因子。楊葉華等［37］指出，生草有利于活化土壤中的元素，提高土壤中有機質含量。本研究也發現，4個人工生草處理土壤有機質含量均高于自然生草，以多年生黑麥草+毛苕子效果最佳。其原因可能是獼猴桃園雜草生長不佳，生物量累計較少，致使土壤有機質含量少于人工生草土壤［38］。

酶作為土壤的組成部分，其活性的大小可較敏感地反映土壤中生化反應的方向和強度［31，39］。綠肥根系的胞外分泌物不僅直接增加了土壤有關酶種類，且根系分泌物和植被有機殘體還提供了多種容易為微生物利用的營養和能源物質，從而增加了土壤微生物和相關酶類的活性［40］。與自然生草相比，多年生黑麥草+毛苕子、多年生黑麥草+草木樨、多年生黑麥草+白三葉和鼠茅草處理均能提高果園土壤脲酶、蔗糖酶、堿性磷酸酶和過氧化氫酶活性，其中，多年生黑麥草+毛苕子提高土壤脲酶、蔗糖酶及堿性磷酸酶活性效果最為顯著。這與陳學森等［41］報道的蘋果園種植毛苕子可顯著提高土壤綜合肥力的結果一致。這可能是由于多年生黑麥草+毛苕子地上部鮮草產量最高，為果園土壤輸入了更多的雜草凋落物和根系分泌物，改變了土壤理化性質，從而引起土壤酶活性的變化［27］。

3.3 不同生草處理對土壤細菌群落結構的影響

細菌作為土壤微生物的主要類群，約占其總體數量的70%～90%，對土壤生態功能的作用至關重要，是土壤質量優劣的敏感指標。本研究利用高通量測序技術，對供試獼猴桃園不同生草模式的土壤細菌群落進行分析。結果表明，變形菌門、酸桿菌門和浮霉菌門為優勢類群。變形菌門細菌是陸地生態系統的主要優勢類群，生態幅度廣，環境適應能力較強［42］。因此，獼猴桃園土壤管理方式的改變對其優勢種群地位的影響較小。鼠茅草處理土壤酸桿菌門相對豐度較自然生草處理提高，這是由于酸桿菌門是嗜酸菌［43］，植被類型會影響其分布［44］，鼠茅草覆蓋后牧草根系分泌物導致土壤pH下降，有利于酸桿菌生存，這與董慧［45］的研究結果一致。陳海生等［46］研究表明，綠彎菌門具有促進土壤有毒物質降解的作用，本研究發現多年生黑麥草+毛苕子和多年生黑麥草+草木樨處理下綠彎菌門相對豐度比自然生草分別提高了0.84和29.47個百分點，表明多年生黑麥草+毛苕子和多年生黑麥草+草木樨處理有利于降低土壤中的有毒物質，改善土壤生態環境。

本研究發現，3個豆禾混播組合（多年生黑麥草+毛苕子、多年生黑麥草+草木樨、多年生黑麥草+白三葉），與自然生草相比，土壤細菌類群的豐富度和多樣性均有所增加，鼠茅草處理土壤細菌多樣性等同于自然生草。這可能是因為生草種類的不同，輸入底物的碳氮比有所不同。由于細菌群落之間存在功能補償性，較高的細菌多樣性可能支持更多的生態系統功能，產生有利于獼猴桃生產的各種物質，從而促進果園增產增收。本研究NMDS分析也表明，獼猴桃園5種生草處理土壤管理模式細菌群落組分未發生統計學意義上的顯著變化，說明獼猴桃園土壤細菌群落較為穩定，短時間內的生草措施影響作用有限。

4 結論

與自然生草相比，4種人工生草均增加了土壤有機質含量，提高了果園土壤脲酶、蔗糖酶、堿性磷酸酶和過氧化氫酶活性，土壤理化性質的改變進而影響了土壤細菌群落結構特征。4種人工生草中多年生黑麥草+毛苕子、多年生黑麥草+草木樨、多年生黑麥草+白三葉提高了土壤細菌群落的豐富度和多樣性，其中多年生黑麥草+毛苕子處理多樣性最高，存在最多差異顯著的細菌分支。相關分析表明，土壤pH和過氧化氫酶活性對細菌群落結構影響較大。本研究通過實踐證明，人工生草對于改善獼猴桃園土壤質量，提高土壤有機質，增加土壤微生物群落多樣性和豐富度均有重要作用，其中多年生黑麥草與毛苕子混播改良效果尤佳。