內生真菌對鹽脅迫下紫花針茅種子萌發和幼苗生長的研究

張鵬，任茜，孟思宇，魏小星，鮑根生

（青海省青藏高原優質牧草種質資源利用重點實驗室，青海大學畜牧獸醫科學院，青海西寧 810016）

土壤鹽漬化通過干擾植物光合作用，抑制植物呼吸作用，降低蛋白質含量、水分虧缺、膜損傷等途徑來抑制植物生長，甚至造成植物死亡，已成為一個亟須解決的全球性問題［1-2］。截至目前，全球共計有8.31×108hm2土地受到鹽漬化威脅［3］；其中，我國鹽漬土壤總面積約為3.6×107hm2，約占全國可用土地面積的4.88%［4］，且大多分布在甘肅、新疆、青海等西北干旱地區。青海省鹽漬化土地面積約2.92×106hm2，主要分布于柴達木盆地、共和盆地和東部農業區［5］，成為制約青藏高原地區生態修復和綠色生態農牧業發展的瓶頸問題之一。鹽漬化土壤改良措施主要有水利改良措施、工程措施與農業措施相結合、施用土壤改良劑、生物改良等［6］，采用水利改良措施、工程措施與農業措施相結合體現出費工費時費力，具有明顯的局限性；施用土壤改良劑雖治理效果明顯，但化學藥劑殘留易引起土壤污染。近年來，利用耐鹽植物對鹽漬化土壤進行生態恢復成為鹽堿化土壤治理行之有效的方法。同時，許多研究發現除耐鹽植物自身耐鹽特性外，微生物與耐鹽植物共生能顯著提高宿主對鹽堿脅迫的耐受能力。例如：鹽脅迫條件下菌根真菌可通過改善寄主植物營養水平、提高植物組織中的K+/Na+以及通過積累如脯氨酸、甘氨酸、甜菜堿和可溶性糖等途徑［7］，提高宿主植物的耐鹽性。同時，研究發現煙草（Nicotiana tabacum）、苜蓿（Medicago sativa）、墨西哥鼠尾草（Salvia leucantha）等植物接種印度梨形孢（Piriformospora indica）能增強其耐鹽能力［8-10］。另外，徐亞軍等［11］研究表明，與對照相比，接種死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis）的小麥（Triticum aestivum）幼苗耐鹽能力顯著增加。由此可見，共生微生物在提高植物耐鹽能力方面發揮重要作用。

禾草內生真菌（Epichlo?）是指存在于植株地上部分，在植物體內完成絕大部分生活周期，但不導致宿主產生外部病害癥狀的一類真菌［12］。經過長期適應性進化，內生真菌與冷季型禾草形成互惠互利的共生體，禾草為內生真菌提供生長場所、繁殖載體（種子）及生長所需營養物質［13］；作為回報，內生真菌通過產生次生代謝物（生物堿）和調控禾草生理生化及代謝途徑增強禾草抗蟲［14］、抗?。?5］、抗旱［16］、耐寒［17］及耐鹽堿［18］等生物或非生物逆境的耐受能力。近期研究發現：禾草內生真菌通過促進植物營養元素吸收、保持離子平衡［19］，提高植物滲透調節能力［20］、增強禾草光合作用和水分利用效率［21］、分泌次生代謝物［22］、誘導相關耐鹽基因表達［23］等途徑提高禾草對鹽脅迫的耐受能力。鹽脅迫作為植物生長發育階段所面臨的最普遍的非生物逆境之一，有關內生真菌如何提高禾草苗期及生長期鹽脅迫耐受能力的作用機理已基本明晰［24］。種子萌發和幼苗定植是植物生命周期中最重要且對外部環境最敏感的時期［25］，這一階段經歷鹽脅迫會對植物幼苗生長和定植產生致命傷害。內生真菌在禾草種子萌發階段能侵染芽原基、葉原基等組織，從而影響非生物脅迫逆境下禾草種子萌發進程［26］。然而，有關內生真菌影響鹽脅迫逆境下禾草種子萌發研究較少，僅聚焦于氯化鈉、硫酸鈉等單鹽對帶菌和不帶菌禾草種子萌發影響，而有關多種單鹽及復合鹽對帶菌和不帶菌禾草種子萌發影響的研究鮮有報道。

紫花針茅（Stipa purpurea）是青海湖流域高寒草原最重要的多年生禾草［27］，其莖葉柔軟，適口性好，耐牧性強。據調查，青海湖流域土壤鹽漬化現象比較嚴重，次生鹽漬化現象也在不斷加?。?8］。調查研究結果表明，青海高原紫花針茅的內生真菌侵染率為70%～100%［29］，基于此，本研究以青海湖流域紫花針茅帶菌（E+）和不帶菌（E-）種子為研究對象，主要解決以下問題：1）隨著鹽濃度增加紫花針茅種子萌發和幼苗生長是否受到抑制？2）單鹽或復合鹽對紫花針茅種子萌發和幼苗生長的抑制作用是否存在差異？3）內生真菌能否提高鹽脅迫逆境下紫花針茅種子發芽和幼苗生長？旨在嘗試利用內生真菌-紫花針茅共生體開展高寒區鹽堿草地生態修復和改良方面的研究，為利用共生微生物實現耐鹽堿種質資源創新利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫花針茅種子采集：2019年10月，在青海省海北州海晏縣甘子河鎮天然草地（37°07′09″N，100°38′42″E），采收紫花針茅成熟種子。采收地海拔3370 m，屬典型高寒草原，草地建群種為紫花針茅，伴生種為冰草（Agropyron cristatum）和草地早熟禾（Poa pratensis）。為保證采集樣品能真實反映樣地紫花針茅種群分布特征和個體水平多樣性，采收400株紫花針茅整株（地上部分），每株間隔25 m左右。采集樣品置于4 °C冰箱內，以備后用。

內生真菌分離鑒定：根據李春杰等［30］禾草內生真菌檢測方法，檢測紫花針茅帶菌率，發現紫花針茅內生真菌帶菌率高達90%以上。同時，挑選20粒帶菌紫花針茅種子進行種皮消毒，然后擺放在馬鈴薯（Solanum tuberosum）葡萄糖瓊脂培養基上，室溫黑暗條件下培養28 d，種子表面出現內生真菌菌絲后進行純培養。參照鮑根生等［31］紫花針茅內生真菌鑒定方法，利用tub、tef和actin特異性引物擴增內生真菌序列并構建系統發育樹，將采集地紫花針茅感染的內生真菌鑒定為Epichlo?inebrians。

E-種子獲?。翰糠諩+種子用有效成分10%的甲基托布津浸泡6 h［32］，對照組采用蒸餾水浸泡E+種子6 h。將E+、E-種子（甲基托布津浸泡處理）播種于裝有滅菌細沙和土壤的250 mL花盆內，細沙與土壤比例為2:1。2020年5月，將E+和E-紫花針茅幼苗移栽至青海省海北藏族自治州西海鎮多年生牧草試驗站（36°49′29″N，101°45′26″E）。9月中旬，紫花針茅種子成熟期按單株收獲方法分別采收E+和E-種子，隨機挑選10株紫花針茅E+、E-種子50粒進行內生真菌侵染率檢測。具體方法為：1%次氯酸鈉浸泡種子過夜，種皮軟化后用苯胺藍染液染色，20×光學顯微鏡下檢查種皮、糊粉層內是否出現藍色光滑菌絲。檢測結果表明紫花針茅E+、E-種子帶菌率分別為100%、4%。

1.2 試驗方法

1.2.1鹽脅迫處理 選取籽粒飽滿、無病蟲害的紫花針茅E+、E-種子各5000粒，供試種子先用70%乙醇消毒1 min，然后用1%次氯酸鈉消毒5 min，最后用蒸餾水沖洗數次后晾干。2021年6月，采用不同濃度的NaCl、Na2SO4、Na2CO3、NaHCO3單鹽溶液及NaCl/Na2CO3混合鹽溶液（NaCl和Na2CO3的比例按1:1進行配制）對紫花針茅E+、E-種子進行鹽脅迫處理；由于青海湖流域土壤以重碳酸鹽類鈣型（HCO3-Ca）分布最為廣泛［33］，柴達木盆地鹽堿化土壤主要以HCO3-、Cl-為主［34］，且CO32-在溶液中會水解為HCO3-，因此選用NaCl/Na2CO3混合鹽溶液。依據王正鳳［35］在鹽脅迫條件下E+、E-野大麥（Hordeum brevisubulatum）種子萌發特性研究結果，本研究單鹽和復合鹽設定低鹽（100 mmol·L-1）和高鹽（400 mmol·L-1）2個水平，添加同體積蒸餾水處理為對照。50粒消毒處理的紫花針茅E+或E-種子擺放于直徑9 cm、鋪有兩層濾紙的培養皿內。同時，分別向每皿內添加不同類型鹽溶液或蒸餾水3 mL，并記錄每皿初始重量。每隔48 h，更換濾紙并補足鹽溶液或蒸餾水至初始重量。依據試驗設計：帶菌狀態（E+、E-）、3個鹽濃度（0，100，400 mmol·L-1）、5種鹽溶液（4種單鹽和1種復鹽）和各處理5個重復，共計150皿。將供試培養皿置于25 °C的培養箱（RTOP，杭州拓普儀器有限公司）內進行培養，光照和黑暗交替時間分別為8和16 h，每隔4 h觀察并記錄每皿種子發芽數量，胚根突破種皮2 mm視為發芽種子。連續觀察直至3 d內未出現發芽種子視為發芽結束，統計種子發芽率。同時，每皿隨機挑選10株幼苗測量幼苗高度和胚根長度。

1.2.2測定指標 發芽率（germination rate，GR，%）=（n/N）×100（n為發芽結束后發芽種子數量，N為供試種子數）［36］；

發芽指數（germination index，GI）=∑(Gt/Dt)(Gt為第t天的發芽數，Dt為相應的發芽天數)[37]；

發芽勢（germination power，GP）=種子發芽達高峰時的發芽數/供試種子數［37］；

相對鹽害率（relative salt damage rate，RSD，%）=（對照發芽率-處理發芽率）/對照發芽率×100［38］。

1.3 數據分析

采用一般線性模型分析內生真菌、鹽濃度和鹽類型對紫花針茅種子萌發（發芽率、發芽指數、發芽勢）和幼苗生長特性（幼苗高度和胚根長度）及相對鹽害率的影響；其中，鹽濃度、鹽類型、帶菌狀態為固定因子，種子萌發和幼苗生長特性及相對鹽害率為響應變量，綜合分析鹽濃度、鹽類型及帶菌狀態對響應變量的影響，檢測固定因子是否對響應變量存在交互作用。若鹽濃度、鹽類型、帶菌狀態對種子萌發和幼苗生長特性及相對鹽害率存在顯著影響，采用單因素方差分析鹽濃度對種子萌發和幼苗生長特性及相對鹽害率的影響；同時，采用獨立樣本T檢驗檢測相同鹽類型、同一濃度下E+、E-紫花針茅種子發芽、幼苗生長和相對鹽害率之間的差異。為滿足方差齊性要求，發芽率、發芽勢和發芽指數數據采用對數轉化，幼苗高度和胚根長度采用反正弦轉化。所有數據均用平均值±標準差表示，采用SPSS 19.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 內生真菌對鹽脅迫紫花針茅種子萌發特性的影響

帶菌狀態、鹽類型和鹽濃度對紫花針茅種子萌發特性存在極顯著影響（P＜0.01，表1）；其中，帶菌狀態與鹽濃度、帶菌狀態與鹽類型對發芽指數存在顯著交互作用，帶菌狀態、鹽濃度和鹽類型對種子發芽率和發芽指數存在顯著三者交互作用（P＜0.05，表1）。隨鹽濃度增加，紫花針茅種子發芽率、發芽勢和發芽指數快速降低，400 mmol·L-1鹽濃度下，發芽率、發芽勢、發芽指數最低（圖1～3）。內生真菌侵染顯著影響紫花針茅在不同鹽濃度下種子發芽率，低鹽或高鹽濃度下，E+種子發芽率顯著高于E-種子；而無鹽條件下，E+、E-種子發芽率、發芽勢和發芽指數差異不顯著（圖1～3）。不同鹽類型對紫花針茅種子萌發抑制作用存在顯著差異（表1）；其中，NaCl對種子萌發抑制作用最弱（圖1a、2a、3a），Na2SO4對種子萌發抑制作用最強（圖1b、2b、3b）。

表1 內生真菌侵染、鹽類型和鹽濃度對紫花針茅種子發芽率、發芽勢、發芽指數影響的三因素方差分析Table 1 Results of three-way ANOVA for endophyte infection status（E），salt type（ST）and salt concentration（SC）on seed germination rate，germination power，germination index of S.purpurea

2.2 內生真菌對鹽脅迫紫花針茅幼苗生長特性的影響

與紫花針茅種子萌發特性結果相似，鹽類型、內生真菌侵染狀態、鹽濃度對紫花針茅幼苗高度和胚根長度存在極顯著影響（表2，P＜0.01）。其中，帶菌狀態與鹽濃度、鹽類型與鹽濃度對幼苗高度和胚根長度存在顯著交互作用，同時，帶菌狀態、鹽濃度和鹽類型對胚根長度存在極顯著三者交互作用（表2，P＜0.01）。隨鹽濃度增加，紫花針茅幼苗高度和胚根長度快速降低，400 mmol·L-1鹽濃度下，幼苗高度最低，胚根最短（圖4和圖5）。內生真菌侵染顯著影響紫花針茅幼苗和胚根生長（表2，圖4和圖5），其中，同一類型鹽溶液在相同濃度下E+植株幼苗高度和胚根長度顯著高于E-植株（圖4和圖5，P＜0.05）；同時，對照組內E+植株幼苗高度也顯著高于E-植株（圖5，P＜0.05）。不同鹽類型對紫花針茅幼苗高度和胚根長度抑制作用存在顯著差異（表2）；其中，NaCl對幼苗高度和胚根長度抑制作用最弱（圖4a和圖5a），Na2CO3對幼苗高度和胚根長度抑制作用最強（圖4d和5d）。

2.3 內生真菌對紫花針茅種子萌發相對鹽害率的影響

內生真菌侵染、鹽類型、鹽濃度能極顯著影響紫花針茅種子萌發相對鹽害率（表2，P＜0.01）；其中，內生真菌侵染、鹽類型、鹽濃度對紫花針茅種子萌發相對鹽害率存在極顯著交互作用（表2，P＜0.01）。隨鹽濃度增加，紫花針茅種子萌發相對鹽害率持續增加，400 mmol·L-1鹽濃度下，種子萌發相對鹽害率最高；對照組種子萌發相對鹽害率為0（圖6）。同時，內生真菌侵染能顯著緩解紫花針茅種子萌發相對鹽害率，表現出E-種子萌發相對鹽害率顯著高于E+種子（圖6）。另外，不同類型鹽溶液對紫花針茅種子萌發相對鹽害率存在顯著差異（表2），其中，Na2CO3和Na2SO4種子萌發相對鹽害率較高而NaCl最低（圖6）。

表2 內生真菌侵染、鹽類型和鹽濃度對紫花針茅幼苗生長（幼苗高度和胚根長度）特性及相對鹽害率影響的三因素方差分析Table 2 Results of three-way ANOVA for endophyte infection status（E），salt type（ST）and salt concentration（SC）on relative salt damage rate，seedling height and radicle length of S.purpurea

3 討論

種子萌發和幼苗定植階段是植物種群形成、擴張和持續更新的關鍵時期，也是植物對外界生物和非生物逆境響應的最敏感時期。Dissanayaka等［39］研究發現，植物是否能正常生長通常取決于種子萌發和成苗這兩個關鍵階段。也有研究表明，種子萌發階段對外界環境十分敏感，易受環境因子的影響［40］。鹽脅迫是種子萌發階段最常見的脅迫因子，種子在鹽脅迫環境中表現出發芽率低、發芽緩慢、發芽種子后期死亡現象頻發等特征，尤其對于鹽敏感型植物［41］。本研究發現，紫花針茅種子在不同鹽種類脅迫環境中存在種子發芽率低、發芽速度慢、幼苗和胚根生長受抑現象，這主要與植物對鹽離子的吸收有關：一方面，鹽脅迫條件下，植物生理生化過程會遭到破壞，使植物體內積累大量鹽離子，致使其滲透勢增高，造成植物缺水［42］；另一方面，細胞受到外界脅迫壓力時，會導致細胞膜透性增大，進而損傷細胞膜的正常生理、代謝功能，對植物產生毒害作用［43］。也有研究發現，在低鹽濃度的生長環境中，鹽中的無機離子作為滲透調節物質，不僅可縮短種子萌發時間，提高發芽率，一定程度上也會促進胚根生長，提高發芽勢、發芽指數、幼苗高度和胚根長度［44］。

不同類型鹽溶液對植物種子萌發和幼苗生長影響存在明顯差異。邸桂俐等［45］研究表明，隨著鹽濃度的增加，Na2CO3對于鎖鏈稗（Echinochloa crusgalli）種子的發芽率、發芽指數以及發芽勢的抑制作用大于NaHCO3和NaCl。同樣，雷春英等［46］研究發現鹽分對鹽爪爪（Kalidium foliatum）種子萌發和幼苗生長的毒害性最大的為Na2CO3、Na2SO4，NaCl毒性最弱。本研究發現，不同類型鹽對于紫花針茅種子萌發的抑制性不同，Na2SO4、Na2CO3對種子發芽勢和發芽率抑制作用最大；此外，Na2CO3和Na2SO4相對鹽害率最大，表明這兩種鹽對紫花針茅種子毒害性最強；與之相反，NaCl對紫花針茅種子萌發相對鹽害率最低，表明NaCl對種子萌發的危害性最小，這與前人的研究結果相似［47］。造成這種現象的主要原因為：1）Na2CO3、Na2SO4均為強堿弱酸鹽，堿性強，pH高，造成植物細胞結構與功能被破壞，離子平衡被打破［48］；2）堿性鹽對植物種子萌發和幼苗生長的毒害作用明顯高于鹽離子引起的毒害作用，造成種子幼苗和根生長時間縮短，甚至無根［45］；3）NaCl在自然界中普遍存在，很多禾草都對其具備一定耐受性。同時，本研究也發現，Na2SO4對紫花針茅種子抑制作用最強，而NaCl抑制作用最弱。由此可見，不同類型鹽對植物種子萌發的抑制作用表現出種間差異性，這可能與植物種子遺傳背景、種子成熟環境及種子萌發階段土壤鹽類型等因素有關［49］。另外，NaCl和Na2CO3混合鹽對種子萌發抑制作用較小，這與盧艷敏等［50］混合鹽脅迫對白三葉（Trifolium repens）種子萌發的抑制作用低于相應濃度Na2CO3脅迫的研究結果相似。主要原因是Cl-代替了一半CO32-，造成CO32-鹽害作用小。同時，Cl-、CO32-離子間競爭也能緩解了CO32-毒害作用［50］。

青藏高原西部、東部土壤以SO42-鹽為主，Cl-、HCO3-鹽次之，CO32-鹽含量較低［51］。本研究發現SO42-鹽對于紫花針茅種子萌發的抑制作用極強，但紫花針茅作為青海湖流域高寒草地主要優勢禾草，其原因可能與分蘗是紫花針茅個體增加的主要繁殖方式的繁殖策略有關［52］；同時，紫花針茅成株耐鹽能力較強，其體內耐鹽相關基因會在高鹽濃度下超表達［53］。綜上所述，紫花針茅采用間歇式種子萌發策略，尋找種子適宜萌發最佳土壤環境，形成更新群體。此外，成株強耐鹽能力也為種群擴張提供保障。上述結論也從側面支撐紫花針茅成為環青海湖鹽堿化危害嚴重地區建群禾草的潛在原因。

眾多研究表明，內生真菌能顯著提高鹽脅迫條件下野大麥［54］、醉馬草（Achnatherum inebrians）［55］、中華羊茅（Festuca sinensis）［56］、高羊茅（Festuca arundinacea）［55］、披堿草（Elymus nutans）［57］、黑麥草（Lolium perenne）［58］等冷季型禾草種子萌發能力。鹽脅迫逆境下，內生真菌通過提高抗氧化酶活性、降低丙二醛含量和增加脯氨酸含量等生理途徑來增強禾草種子萌發能力［59］。另外，內生真菌也通過調節種子滲透能力、增強種子活性氧清除能力和降低膜脂過氧化傷害等途徑緩解鹽脅迫逆境對禾草種子傷害［59］。本研究發現，內生真菌能顯著提高紫花針茅種子萌發和幼苗生長階段的耐鹽性，這可能與內生真菌促進禾草種子細胞滲透能力和增加抗氧化酶的活性，從而保護鹽脅迫環境下紫花針茅種子細胞膜受損，維持細胞內外離子含量平衡，促進種子處于水分充盈環境，從而保證紫花針茅種子能正常完成種子萌發［60］。

大量研究表明，E+紫花針茅相對鹽害率低于E-。強Na2CO3和Na2SO4鹽脅迫環境下，E+種子對鹽害耐受力顯著高于E-，這與其他E+、E-禾草在鹽脅迫下種子萌發和幼苗生長階段的對比研究結果一致［61］。同時，鹽脅迫環境中E+種子表現出萌發數量多、萌發速度快等特征，從而證實內生真菌能顯著影響鹽脅迫逆境下種子萌發進程，增加種子對鹽脅迫環境的耐受能力［61］。另外，隨著種子萌發過程結束，地上葉片持續伸展，內生真菌將在葉部細胞隙間不斷擴張繁殖，表現出宿主生長同步性［62］。眾多研究表明，內生真菌在鹽脅迫環境中能提高禾草苗期光合能力，從而儲備更多碳水化合物供地上組織生長和地下根系發育，進而表現出幼苗階段E+植株葉片大、分蘗多、莖稈壯等表型特征；與之相反，E-幼苗由于缺少內生真菌侵染則在鹽脅迫條件下表現出葉片窄短、分蘗稀疏和莖稈纖細等特征［63］，本研究結果與其相吻合。

由此可見，內生真菌侵染能顯著提高紫花針茅種子萌發和幼苗定植能力，這一結果也為紫花針茅成為青海湖流域高寒草原優勢禾草提供直接證據，表明內生真菌侵染可能成為紫花針茅適應青海湖濱鹽漬化土壤且成為建群物種的主要原因之一。同時，后續將開展E+、E-幼苗生長階段內生真菌是否通過調控細胞內外鹽離子平衡、清除活性氧能力及增加抗氧化物質等方面研究，從而揭示內生真菌提高紫花針茅耐鹽性的生理生化機理。

4 結論

隨鹽濃度不斷增加，紫花針茅種子發芽率、發芽勢、發芽指數持續降低，胚根發育和幼苗生長受到嚴重抑制。同時，不同鹽類型對紫花針茅種子萌發和幼苗生長特性表現出差異，Na2CO3和Na2SO4對紫花針茅種子萌發和幼苗生長相對鹽害率最高。另外，內生真菌侵染能顯著提高紫花針茅種子發芽率、發芽勢、發芽指數、胚根長度和幼苗高度，表現出E+紫花針茅種子相對鹽害率低于E-；其中，內生真菌侵染后紫花針茅對Na2CO3脅迫的耐受能力最強。綜上所述，內生真菌侵染是紫花針茅適應青海湖流域鹽漬化土壤且成為高寒草原優勢禾草的主要原因之一，這將為利用內生真菌-紫花針茅共生體進行鹽堿地改良和耐鹽禾草種質創新奠定理論基礎。