MMP1基因rs491152多態性與COPD發生和發展的相關性分析*

唐李鳳，鐘雪梅，馬 濤，弓 慧，鄭愛芳，解承鑫，李菲菲，李 黎,△

1.石河子大學醫學院，新疆石河子 832000；2.喀什地區第一人民醫院呼吸與危重癥醫學科，新疆喀什844000；3.喀什地區第一人民醫院新疆感染性疾病(結核病)臨床醫學研究中心，新疆喀什 844000

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種常見的呼吸道疾病，位于中國主要死因的第4位[1]。一項流行病學調查顯示，中國喀什地區農村40歲以上維吾爾族人群COPD的發病率高達17.01%[2]，明顯高于全國平均水平[3]。遺傳因素在COPD的發生和發展過程中起重要作用[4]，在中國維吾爾族人群中鑒定COPD相關的基因突變可以對其提供一定依據和理論基礎，幫助理解這一現象。目前隨著高通量測序技術的廣泛應用，基因組學的研究可以把分子診斷策略廣泛地應用于COPD的診斷和治療中。蛋白質編碼基因僅占人類基因組的1%左右，但包含所有突變的85%，并且明顯影響疾病的相關性狀[5]，全外顯子測序(WES)有助于獲得對各種人類疾病的相關見解[5]。本研究對3個維吾爾族COPD家系進行WES，經過生物信息學分析，獲得一個新的候選突變——基質金屬蛋白酶1(MMP1)基因rs491152[6]。蛋白酶-抗蛋白酶失衡是COPD的眾多重要病理特征之一，抗蛋白酶相對缺乏，肺組織結構被分解破壞可導致終末氣道擴張而引起肺氣腫。MMPs能夠降解許多細胞外分子和生物活性分子，是降解細胞外基質的主要蛋白酶[7]。MMP1基因位于染色體11q22.3，包含10個外顯子，是MMP基因簇的一部分，在細胞外基質重塑中降解纖維性膠原。長期吸入香煙煙霧(CS)會誘發蛋白過度水解，CS可能通過激活細胞外信號調節激酶1/2信號轉導通路[8]和Toll樣受體4信號級聯反應[9]介導MMP1表達增加，從而導致肺組織過多破壞，進而發展為肺氣腫。多項研究表明，MMP1在COPD患者血清中表達增加，且受CS的明顯影響，提示MMP1在COPD的病理生理機制中發揮重要作用[9-11]。單核苷酸多態性(SNP)是個體最常見的遺傳變異，可能影響啟動子活性(基因表達)、信使 RNA構象及mRNA和(或)蛋白質的亞細胞定位，進而參與疾病的發生和發展[12]。MMP1基因SNPs可能與COPD的發生和發展密切相關[13-15]，但此前關于MMP1基因在COPD中的研究多集中在啟動子中 (-1607 1G/2G) 的rs1799750 SNP，且結論存在爭議[13-18]。更多多態性位點對于理解MMP1基因SNPs在COPD的發生和發展中的作用至關重要。此外，MMP1基因rs491152多態性與COPD肺功能評估指標是否相關，能否成為未來預測COPD發生和發展的標志物，亟待進一步研究。本研究旨在通過基于喀什地區維吾爾族人群的病例對照研究來評估MMP1基因rs491152多態性與COPD發生和發展的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018-2019年于喀什地區招募病例對照研究隊列入組。541例COPD患者(病例組)和534例健康對照者(對照組)均來自喀什地區第一人民醫院，其中病例組男280例，女261例；對照組男234例，女300例。COPD的診斷符合COPD全球倡議概述的診斷標準，即吸入支氣管擴張劑后第1秒用力呼氣容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)<70%[19]。受試者的納入和排除標準與GONG等[20]報道一致。所有受試者為3代以上居住在喀什地區的維吾爾族人群，年齡均大于40歲。錄入所有受試者的性別、年齡、體質量指數(BMI)、吸煙狀況等基線資料。本研究通過喀什地區第一人民醫院倫理委員會審核批準，所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2MMP1基因rs491152位點的來源 MMP1基因rs491152位點來源于COPD家系的WES，具體篩選說明詳見XU等[6]的研究報道。WES被用于3個家庭共9名成員(8名患者，1名健康對照者)。通過WANG等[21]研究(https://annovar.openbioinformatics.org/)進行突變注釋，并將單核苷酸變異(SNV)在1000 Genomes、COSMIC、ClinVar、esp6500、ExAC_ALL、GWAS Catalog等不同數據庫進行比較，從而得到更為準確的注釋結果。之后對上述步驟獲得的SNV進行生物信息學分析，包括致病性評估、GO富集分析、通路富集分析及蛋白質相互作用網絡分析等。最終篩選出在家系中患病與健康成員之間差異表達位點——MMP1基因rs491152。

1.3DNA提取及目標位點基因分型 于清晨時采集1 075例受試者空腹外周靜脈血5 mL，采用Greiner基因組DNA提取試劑盒(Greiner、Pleidelsheim、Germany)按照說明書步驟從全血中提取DNA。NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA)用于檢測DNA純度。采用48-Plex SNPscan試劑盒(Center for Genetic & Genomic Analysis,Genesky Biotechnologies Inc.,Shanghai,China)對目標位點進行Sanger測序[20]。分型成功率在98%以上。最后采用ABI3730XL(ABI、USA)測序器和Genemapper4.1(AppliedBiosystems,USA)分析位點多態性。

2 結 果

2.1兩組一般資料比較 兩組在煤炭暴露史、木炭暴露史和家庭年收入方面比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；兩組在年齡、性別、BMI、吸煙狀況、吸煙指數(SI，SI=每天吸煙支數×吸煙年數)、FEV1%和FEV1/FVC方面比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較[n(%)或或M(P25～P75)]

組別n吸煙狀況從不吸煙曾吸煙當前吸煙SI<1≥1～400>400～800>800病例組541 417(77.08)23(4.25)101(18.67)417(77.08)98(18.11)16(2.96)10(1.85)對照組534465(87.08)17(3.18)52(9.74)465(87.08)52(9.74)11(2.06)6(1.12)P<0.001<0.001

組別n煤炭暴露史是否木炭暴露史是否肺功能指標FEV1(%)FEV1/FVC病例組541513(94.82)28(5.18)519(95.93)22(4.07)69.00(53.92～82.00)0.62(0.55～0.66)對照組534516(96.63)18(3.37)500(93.63)34(6.37)86.00(74.00～98.00)0.80(0.75～0.86) P0.1440.090<0.001<0.001

2.2Hardy-Weinberg平衡檢驗 分別對病例組和對照組中所檢測到的MMP1基因rs491152基因型分布頻率進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，結果顯示，此多態性位點的基因型在對照組中分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，具有群體代表性。

2.3MMP1基因rs491152與COPD風險的相關性分析 MMP1基因rs491152位點在病例組和對照組的分型成功率分別為98.89%(535/541)、99.63%(532/534)。多因素Logistic回歸分析結果顯示，rs491152位點在所有遺傳模型下與COPD風險比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 MMP1基因rs491152基因型和等位基因頻率在病例組和對照組中的分布情況比較[n(%)]

2.4吸煙組和非吸煙組中MMP1基因rs491152的基因型分布及其與COPD風險的相關性分析 根據吸煙史進行亞組分析，采用校正年齡、性別和BMI后的多因素Logistic回歸方法進行統計學分析，結果顯示，非吸煙組和吸煙組中rs491152與COPD風險比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 MMP1基因 rs491152在吸煙組和非吸煙組中的遺傳模型分析

2.5MMP1基因rs491152多態性與COPD患者肺功能損傷的關系 多因素Logistic回歸分析結果顯示，MMP1基因rs491152多態性與肺功能嚴重程度評估指標之間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 MMP1基因rs491152在病例組不同FEV1%中的分布情況比較[n(%)]

3 討 論

COPD是一種復雜的、多因素的、多基因的疾病[22]。許多研究試圖通過尋找突變來評估基因與COPD之間的關系。本研究對來自3個維吾爾族COPD家系的受試者進行了WES，經過生物信息學分析，獲得了在患者和健康成員間差異表達位點MMP1基因rs491152。本研究在喀什地區維吾爾族人群中進一步評估了MMP1基因rs491152與COPD發生和發展的相關性，然而并沒有觀察到MMP1基因rs491152對COPD的致病或保護作用，并且與是否吸煙無關。在對FEV1%的分層分析中發現，rs491152 SNP也不影響肺功能的嚴重程度。

蛋白酶介導的彈性蛋白破壞的是肺實質中的主要結締組織成分，被認為是肺氣腫的一個重要特征[22]。MMP1基因主要作用底物為纖維性膠原，可降解細胞外基質中的膠原纖維[7]，從而在呼吸道組織重塑的調節過程中起重要作用。進行性肺泡損傷是由于選擇性細胞外基質成分的降解，這可能與其不受調控、過度的蛋白質水解有關[23]。SNPs與基因表達、功能、表型和疾病均有關[12]，識別基因中的許多變異并分析其影響可能會有助于更好地理解它們對基因功能和個體健康的影響。遺傳證據表明，MMP1基因啟動子多態性-1607 1G/2G與COPD易感性相關，突變純合子GG/GG基因型是COPD的高危因素[14-15]。JOOS等[13]研究發現，-1607 1G/2G與連續吸煙者肺功能下降率相關，且-1607 GG等位基因明顯影響肺功能的快速下降率。然而，遺傳研究并沒有提供一致的結果。BCHIR等[18]研究表明，MMP1基因-1607 1G/2G、-519 A/G可能不影響突尼斯人群COPD風險和疾病嚴重程度。在中國北方漢族、韓國人群中同樣未觀察到MMP1基因-1607 1G/2G與COPD易感性的相關性[16-17]。HERNANDEZ-MONTOYA等[24]在330例有吸煙史COPD患者、658例無吸煙史COPD患者和150例健康非吸煙者中評估了MMP1基因其他3個位點(rs470215、rs7125062、rs2071232)，但這些SNPs與墨西哥人群COPD并不相關。本研究在1 075例維吾爾族受試者中嘗試尋找新突變，然而并未觀察到MMP1基因rs491152 SNP與COPD易感性、嚴重程度之間的明顯關聯。此外，在本研究的吸煙分層分析中，MMP1基因rs491152同樣未顯示出與COPD易感性明顯關聯。基于上述文獻資料可發現，MMP1基因SNPs與COPD的相關性仍存在爭議，出現這種現象的原因可能是：樣本量小、遺傳異質性、環境(CS暴露)異質性等。

本研究納入的COPD樣本為散發人群，覆蓋了喀什地區下轄的大部分區域，在一定程度上降低了選擇偏倚對結果的影響。在吸煙狀況的亞組分析中觀察到rs491152多態性與COPD易感性無明顯相關性，而吸煙組的樣本量較少，這只能表明MMP1基因rs491152可能不是預測非吸煙人群COPD易感性的重要標志物。鑒于MMP1基因參與CS相關的肺氣腫病理機制，因此，有必要通過擴大吸煙組樣本量來進一步評估二者的關系。值得注意的是，這項研究的人群驗證是基于喀什的民族特征——維吾爾族，這并不意味著rs491152 SNP與其他人群的COPD無關，尤其是吸煙人群。

維吾爾族COPD家系WES篩選出一個COPD潛在的候選突變——MMP1基因rs491152，基于人群的病例對照研究卻表明MMP1基因rs491152 SNP可能不是預測中國維吾爾族非吸煙人群COPD發生和發展的重要標志物。盡管MMP1基因與CS誘發的肺氣腫密切相關，然而支持膠原分解參與COPD病理機制的證據不足，其在COPD發生和發展機制中的確切功能仍然是一個懸而未解決的問題。MMP1基因rs491152 SNP與其他人群COPD的關系，尤其是吸煙人群，以及MMP1基因更多位點在COPD病理機制中的作用有待進一步探索。