罕見類抗-A1抗體引起ABO血型正反定型不符多因素分析*

楊紅梅，鄒 昕#，虞 茜，許 飛，徐 立△

1.江蘇省常州市中心血站,江蘇常州 213000,2.江蘇省常州市臨床輸血重點專科實驗室,江蘇常州 213000

ABO血型系統是最早被發現的人類血型系統，其基因位于第9號染色體，同時也是最重要的一個血型系統，在臨床輸血、移植醫學和產前診斷中具有重要意義。在日常ABO血型鑒定工作中，常常會碰到正反定型不一致，在排除人為操作因素外，不規則抗體和亞型往往是研究者考慮的方向[1-3]。本實驗室在ABO血型鑒定過程中發現1例正反定型不符標本，該標本血型血清學無法判斷其血型，借助不規則抗體篩查、吸收放散試驗、凝集抑制試驗、酶處理試驗、不同溫度效價試驗、溶血率監測等檢測手段，并結合聚合酶鏈反應-序列特異性引物(PCR-SSP)基因分型和ABO基因第6、7外顯子擴增產物基因測序，最后確定其血型為A101型。該病例為A型罕見的產生了類抗-A1抗體，目前國內少見其相關報道。

1 資料與方法

1.1一般資料 常某某，男，74歲，江蘇常州人，漢族，2021年3月3日因肩骨疼痛入住常州市中醫醫院，術前常規備血過程中發現其鑒定正定型為A型，反定型為O型，正反定型不符，于當天送常州市中心血站輸血研究室進行血型鑒定。

1.2儀器與試劑 抗-A/B單克隆抗體(上海血液生物醫藥有限責任公司，批號：20200609)、抗-D(IgM)單克隆抗體(上海血液生物醫藥有限責任公司，批號：20200301101)、抗-H抗體(德國CE公司，批號：OHM142)、抗-AB抗體(德國CE公司，批號：OABM083)、抗-A1抗體(上海血液生物醫藥有限責任公司，批號：20200522)、ABO血型反定型紅細胞(北京金豪制藥股份有限公司，批號：2021101001)、人源抗-A/B單克隆抗體(自制)、血型分析液(上海血液生物醫藥有限責任公司，批號：20216201)、血型試劑質控試劑盒(上海申型醫學科技有限公司，批號：20227202)、抗-Lea和抗-Leb抗體(德國CE公司，批號：OLeaM121-1和OLebM110-1)、抗體篩選細胞(匈牙利REAGENS公司,批號：702013)、微量游離血紅蛋白(FHb)檢測試劑盒(QuantiChrom公司，批號：210114)、ABO-PCR-SSP基因分型試劑盒(天津市秀鵬生物技術開發有限公司，批號：K202008006)、DNA提取試劑(美國Invitrogen公司，批號：15101)、瓊脂糖(北京沃森生物科技有限公司，批號：181650)、溴化乙錠(10 mg/mL，青島捷世康生物科技有限公司)。美國AB公司9700型PCR擴增儀、DNA濃度測定儀、凝膠成像系統、美國貝克曼庫爾特的高速離心機、日本久保田的KA-2200型血清學專用離心機。37 ℃恒溫水浴箱、湖南盧湘儀的TD4低速自動平衡離心機、北京瑞爾達生物科技有限公司的F4040半自動生化分析儀。

1.3血清學檢測 采用試管法進行ABO正反定型試驗。取B型獻血者、O型獻血者和患者紅細胞少許，生理鹽水洗滌3次，配制成2%紅細胞懸液進行抗-H、抗-A1和抗-AB試驗，離心判讀凝集強度；同時對該標本進行抗體篩查。所有試驗均嚴格按照《AABB技術手冊(第18版)》[4]和文獻[5]的方法及試劑操作說明書進行。

1.4PCR-SSP基因組DNA提取及ABO基因擴增、圖譜比對分析 采用Invitrogen公司DNA提取試劑盒提取患者外周血基因組DNA，調整DNA模板濃度為30～35 ng/μL，A260/A280為1.60～1.80，根據人類ABO血型基因檢測試劑盒說明書設置參數進行PCR擴增；取擴增產物于2%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像分析系統進行分析，并與天津市秀鵬生物技術開發有限公司提供的圖譜比對分析結果。

1.5ABO基因測序分析和序列比對 ABO基因第6、7外顯子擴增片段大小約為2 019 bp，擴增反應體系根據天津市秀鵬生物技術開發有限公司試劑盒說明書進行，采用引物：上游5′-CCTGCCAGCTCCATGTGAC-3′；下游：5′-CAGGACGGACAAAGGA-3′。擴增產物經純化后并測序，該試驗部分在天津市秀鵬生物技術開發有限公司完成。第6外顯子測序引物為上游：5′-CATGTGGGTGGCACCCTGCC-3′；下游：5′-ATGTCCACAGTCACTCGCCA-3′。第7外顯子測序引物為上游：5′-GCTCCCCCAGCCCCCGTCCG-3′；下游：5′-GTTTACCCGTTCTGCTAA-3′。

2 結 果

2.1血型血清學檢測結果 采用試管法對標本進行ABO血型血清學檢測，正定型與抗-A凝集強度可達4+，與抗-B不反應。反定型患者血漿與A細胞(Ac)、B細胞(Bc)呈強凝集，與O細胞(Oc)和自身細胞(自身c)均不反應。進一步試驗發現，H抗原表達強度很弱，與正常Bc幾乎一致(正常O型抗-H凝集強度3+，正常B型抗-H凝集強度1+w/±)，與抗-A1、抗-AB呈4+凝集，排除A2亞型。為排除冷性不規則抗-A抗體，將反定型試管離心于37 ℃孵育15 min后再看結果，與Ac和Bc仍有凝集。為進一步鑒定是否存在同種抗體干擾血型，進行了抗篩試驗，結果在鹽水、凝聚胺、抗人球蛋白3種介質中均無凝聚、無溶血。以上試驗排除了亞型、冷抗體及同種抗體等多因素干擾。

2.2試劑抗體或抗保養液抗體判斷 將反定型試劑細胞經生理鹽水洗滌3次后配成2%左右紅細胞懸液(此時無保養液)進行血型血清學檢測發現反定型Ac呈陰性，但換成血型稀釋液即保養液后反定型Ac呈陽性(有無添加保養液對Oc和自身c均無影響)，見表1。

表1 患者血型血清學檢測結果

2.3多細胞凝集判斷 多凝集紅細胞抗原是由于各種原因產生膜抗原暴露，從而導致多細胞凝集現象，這與臨床疾病、人體免疫機制及紅細胞免疫有關。為驗證是否為多細胞凝集，整個試驗過程參考《AABB技術手冊(第18版)》進行，結果見表2。如果為多細胞凝集，則用酶處理患者細胞A抗原強度大大減弱，而正常A型紅細胞A抗原強度不會減弱，患者紅細胞經木瓜酶處理后A抗原強度并沒有減弱，排除Tn多細胞凝集現象，說明正定型為A型。根據試驗結果，排除多細胞凝集干擾。

表2 Tn多細胞凝集試驗結果

2.4吸收放散試驗 第1組取0.3 mL患者壓積紅細胞(Pc)與0.3 mL等量生理鹽水56 ℃放散10 min；第2組取0.3 mL A型混合Pc加0.3 mL患者血清4 ℃吸收1 h即刻離心，冷鹽水洗滌6次，加等量生理鹽水56 ℃放散10 min；第3組取0.3 mL A型混合Pc加0.3 mL患者血清及2滴血型稀釋液(保養液)4 ℃吸收1 h即刻離心，冷鹽水洗滌6次，加等量生理鹽水56 ℃放散10 min。試驗過程中發現，第2組吸收后血漿呈溶血狀態，即促發溶血反應并且A型紅細胞在無保養液的情況下未能吸收抗-A抗體，所以吸收后血漿抗-A呈陽性而放散試驗呈陰性。而第3組加血型稀釋液(保養液)后抗-A能很好地被A細胞吸附，經56 ℃也能很好地放散下來，見表3。

表3 吸收放散試驗結果

2.5不同抗凝劑的溶血率監測分析 在試驗過程中發現，不同顏色的標本管溶血程度完全不同，紫管第2天出現了肉眼可見的溶血現象。連續10 d監測3種試管中血漿或血清FHb水平，結果見表4、圖1。其中紫管抗凝劑為乙二胺四乙酸，綠管抗凝劑為枸櫞酸鈉，紅管無抗凝劑。紫管與紅管、綠管FHb水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 3種試管連續監測10 d FHb水平比較

注：與紫管比較，*P<0.05。

表4 3種試管中FHb水平比較(g/L)

2.6不同介質中Ac重懸液的抗體效價測定 取380 μL血清加20 μL質控液，加400 μL 2-Me混合于37 ℃水浴箱中破壞30 min，離心后取4滴破壞液和1滴Ac混合離心結果為陰性，說明破壞完全且該抗體為IgM型抗體。采用倍比稀釋測定IgM抗體效價，結果見表5。結果顯示，未加保養液的Ac和該抗體無凝集反應，加保養液后效價達到16，至少增強4管。

表5 不同介質中Ac重懸液的抗體效價測定

2.7唾液試驗 收集患者唾液離心后用玻璃管煮沸10 min再次離心，取上清液備用。同時將抗-A、抗-B、抗-H稀釋調整到2+的凝集強度，標好試管，先加抗-A、抗-B、抗-H 100 μL到試管中，陰性對照管加100 μL生理鹽水，測試管加100 μL唾液，離心混勻置4 ℃ 1 h后加0.8%Ac、Bc和Oc，置4 ℃ 30 min，結果唾液中檢測到A物質和H物質。進一步對患者紅細胞Lewis系統抗原進行測定，表現型為Le(a-b+)，結合結果該患者為A型分泌型，說明該患者反定型抗體并非抗-ALeb抗體。

2.8ABO-PCR-SSP及基因測序 經ABO-PCR-SSP及第6、7外顯子測序，以A101作為測序標準序列，患者第6、7外顯子未見堿基替換和氨基酸替換，表現型為A1，基因測序為ABO*A1.01，見表6。

表6 患者ABO血型第6、7外顯子核苷酸序列結果

3 討 論

類同種抗體指類似于同種抗體性質的自身抗體，但不同于自身抗體。比如RhD(+)患者血漿中有類同種抗-D，該患者血漿中抗-D與其他所有人的RhD(+)紅細胞均反應，但與自身紅細胞不反應，這應該是同種抗體，但又和同種抗體不一樣，所以將這樣的抗體定義為“類同種抗體”。抗-A1有類同種抗-A1抗體，這種抗體除了不與自身紅細胞反應外，能凝集所有A1細胞，與疾病、免疫應答和抗體三維結構改變有關[6]。抗-A1還可能受Rh相關糖蛋白的影響，有文獻報道了1例很獨特的抗-A1，它只凝集A型RhD+細胞，而且這例抗-A1與A1D+細胞反應強于A2D+細胞，同時這例抗-A1不與A1D-細胞反應，也不與O型D+細胞反應[6-7]。被認為是Rh相關蛋白影響了A1細胞在不同RhD(+/-)時與抗-A1的反應情況，可能是因為膜外抗原三維構象改變所致[8]。而抗-A1有類同種抗體，類同種抗-A1抗體可存在于A1型人血漿中，但與自身A1型紅細胞不反應，可與其他人A1型紅細胞反應，這種類同種抗-A1抗體在理論上屬于自身抗體，但其分子生物學結構目前還缺少研究報道。

本病例在鑒定其血型過程中，排除了亞型、冷抗體及同種抗體等多因素的干擾，進一步考慮是否為試劑抗體或者抗保養液抗體導致血型不一致，或存在Tn多細胞凝集或異體抗-A抗體還是抗-ALeb抗體或抗-HA抗體或類抗-A1抗體等多因素，并通過相關血型血清學技術手段一一驗證。在試劑抗體或者抗保養液抗體試驗過程中發現，患者血漿中存在一種和A抗原特異性反應的抗-A抗體，該抗體可以被紅細胞保養液增強，但也很容易被生理鹽水洗脫，且親和力不強。而抗保養液抗體一般反定型Ac、Bc、Oc都凝集(室溫鹽水弱凝集)、與自身c不反應、直接抗人球蛋白試驗陰性、無冷抗體特性及能排除類同種抗體等特點，排除了并非為抗保養液抗體引起的正反定型血型不一致。同時，隨機挑取3位健康A型獻血者和3位健康O型獻血者與本研究的患者進行交叉配血試驗，本研究的患者血清與3位健康A型獻血者用生理鹽水配置的2%紅細胞懸液在鹽水和抗人球蛋白卡中均為陰性，而凝聚胺為陽性，這種情況通常發生在弱冷抗體情況下，但弱冷抗體被保養液明顯增強的案例少見報道。本研究的患者血清與3位健康O型獻血者用生理鹽水配置的2%紅細胞懸液配血在3種介質中均無凝集、無溶血。

總之，ABO血型鑒定極其重要，若存在正反定型不一致時，非常有必要采用血型血清學和分子生物學相結合的方法進行檢測，以確保臨床輸血安全。