瑞香素通過含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶通路對膠原誘導性關節炎大鼠成纖維樣滑膜細胞增殖與凋亡的影響

鄭茂，鄒玉，王潔瑩，況南珍，傅穎媛

作者單位：1德陽市人民醫院檢驗科，四川 德陽 618000；2南昌大學基礎醫學院，江西 南昌 330006；3海南醫學院第二附屬醫院檢驗科，海南 海口 570100

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的全身性自身免疫性疾病，主要病理特征是骨與軟骨組織受損，繼而造成關節破壞［1］。RA病程長、預后差、致殘性大，且病情進行性加重，一直以來是臨床研究關注的重點。然而，RA確切的發病機制仍未完全闡明，目前的研究觀點主要認為與滑膜細胞異常增生密切相關［2］。成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）是RA滑膜內膜襯里的主要填充細胞，在滑膜襯里層處于極度活躍的狀態，呈腫瘤樣增殖，在RA病人滑膜病變及關節損傷中起著關鍵作用［3］。因此，抑制FLS增生對控制RA發病及病情進展具有重要意義。

瑞香素（daphnetin，DAP），化學名7，8-二羥基香豆素，是金邊瑞香、長白瑞香等瑞香屬植物的主要活性成分，為我國自主研發的天然藥物。文獻報道顯示，DAP具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調節等多種藥理作用［4］。本課題組前期研究從金邊瑞香中分離提純出DAP，并發現DAP可抑制膠原誘導性關節炎大鼠（collagen-induced arthritis，CIA，一種類風濕關節炎常用的動物模型）的關節炎癥，改善關節病變，提高Foxp3+Treg細胞水平，使Th17/Treg趨于平衡［5-7］。體外實驗還發現DAP能促使CIA大鼠成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes in collagen-induced arthritic rats，CIA-FLS）的促凋亡基因DR3、PDCD5、FasL、p53去甲基化，以及降低Bcl-2、STAT3基因的表達，使其出現凋亡現象［8-9］。然而，DAP誘導CIA-FLS凋亡的信號途徑尚不清楚。為此，本研究自2018年3―9月利用DAP結合不同特異性含半胱氨酸的胱天蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）抑 制 劑，觀 察DAP對CIA-FLS增殖與凋亡的影響，旨在初步探討DAP誘導CIA-FLS凋亡的可能機制途徑，為DAP用于臨床治療RA提供實驗依據。

1 材料

1.1 細胞系CIA-FLS購于上海研生實業有限公司，許可證號J2900117872001。細胞采用含10%胎牛血清的雙抗DMEM培養液，置于37℃、5%二氧化碳飽和濕度的培養箱內培養，CIA-FLS為貼壁生長。

1.2 藥物DAP化學式C9H6O4，純度≥98%，購于北京索萊寶生物科技有限公司。將20 mg DAP溶于1 mL二甲基亞砜（DMSO）配成20 g/L貯存液，使用時以培養液稀釋至目標濃度。

1.3 試劑caspase-3抑制劑（Casp3-In，美國Selleck公司），caspase-8抑制劑（Casp8-In，美國Santa Cruz公司），caspase-9抑制劑（Casp9-In，美國Santa Cruz公司），泛caspase抑制劑（Pancasp-In，美國Selleck公司），人膽囊收縮素/縮膽囊素八肽（CCK-8）細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（上海貝博生物公司），Hoechst 33258染液（上海貝博生物公司），AnnexinVFITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒（美國BD公司），離心柱型總RNA提取試劑盒（北京天根科技公司），PCR逆轉錄試劑盒（日本TOYOBO公司），Real-time PCR試劑盒（日本TOYOBO公司），PCR引物（北京華大基因公司），含鏈霉素青霉素的DMEM培養液（北京索萊寶生物公司），胎牛血清（天津灝洋生物公司），AccutaseTM細胞分離溶液（美國eBioscience公司）。

1.4 儀器二氧化碳細胞培養箱（美國Thermo Scientific公司），超凈工作臺（上海博迅公司），水平搖床（海門其林貝爾公司），倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司），多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司），流式細胞儀（美國BD公司），PCR熱循環儀（美國Thermo Scientific公司），Real-time PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

2 方法

2.1 CCK-8檢 測DAP對CIA-FLS增 殖 的 影 響取生長良好的對數期CIA-FLS，加入AccutaseTM細胞分離液消化，低速離心收集細胞，再加入培養液重懸后計數細胞濃度，將細胞接種于96孔板（每孔約8×103個細胞）。培養12 h后，加入不同濃度DAP（終濃度分別為0、5、10、20、40、80 mg/L），每個濃度設3個平行孔，對照孔（含細胞）和空白孔（不含細胞）加入等體積培養液。培養48 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，輕輕混勻，并放回培養箱繼續培養1 h再取出，在酶標儀上測定各孔450 nm處的吸光度（OD）。CIA-FLS細胞活力（%）=（實驗孔OD值－空白孔OD值）/（對照孔OD值－空白孔OD值）×100%。

2.2 Real-time PCR檢 測DAP對CIA-FLS中caspase基因的影響取CIA-FLS接種于24孔板（每孔約5×104個細胞），培養12 h后，加入DAP（終濃度為40 mg/L）處理48 h，并設細胞對照孔。培養結束后提取CIA-FLS的總RNA，并進行逆轉錄反應（逆轉錄反應體系：11 μL RNase-free Water，4 μL RT Buffer，1 μL RT Enzyme Mix，1 μL Primer Mix，3 μL Total RNA）。將逆轉錄好的cDNA繼續進行實時熒光定量PCR擴增反應（擴增反應體系：6.4 μL RNase-free Water，10 μL Master Mix，0.8 μL Forward primer，0.8 μL Reverse primer，2 μL cDNA）。每個基因設3個平行管，采用公式2-ΔΔCt計算目標基因caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA相對表達量。

2.3 caspase抑制劑不同條件預處理后，CCK-8檢測DAP對CIA-FLS增殖的影響取CIA-FLS接種于96孔板（每孔約8×103個細胞），培養12 h后，分別加入不同濃度的各caspase抑制劑預處理1、2、4 h，再加入DAP共處理48 h，其中Casp3-In、Casp8-In、Casp9-In終濃度為0、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L，Pancasp-In終濃度為0、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L，DAP終濃度為40 mg/L。其余實驗步驟同2.1，最后計算各孔CIA-FLS細胞活力。

2.4 Hoechst 33258熒光染色觀察CIA-FLS凋亡形態取CIA-FLS接種于24孔板（每孔約5×104個細胞），培養12 h后，分別加入各caspase抑制劑預處理2 h，再加入DAP共處理48 h，其中Casp3-In、Casp8-In、Casp9-In終濃度為5 μmol/L，Pancasp-In終濃度為20 μmol/L，DAP終濃度為40 mg/L，并設細胞對照孔。培養結束后，吸去各孔培養液，加入PBS洗滌1 min。將Hoechst 33258染液稀釋30倍制成染色工作液，每孔加入200 μL染色工作液，室溫避光染色10 min。吸去染色液，加入PBS水平緩搖洗滌3 min，重復3次。染色完成后盡快置于熒光顯微鏡下，選擇340～350 nm藍色激發光觀察細胞凋亡形態，并拍照留存。

2.5 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測CIA-FLS凋亡率細胞分組同“2.4”，CIA-FLS培養48 h后，加入AccutaseTM細胞分離液，室溫消化后低速離心，使用流式管收集細胞。每管加入預冷PBS洗滌2次，低速離心后棄盡上清，加入200 μL Binding Buffer重懸細胞，再分別加入5 μL Annexin VFITC和5 μL PI，室溫避光孵育15 min，最后上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

2.6 統計學方法采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 DAP對CIA-FLS增殖的影響如圖1所示，倒置顯微鏡下可觀察到CIA-FLS為成纖維樣生長形態，貼壁狀態良好，細胞排列均勻；經DAP作用后CIA-FLS生長狀態受到抑制，細胞數量明顯減少，細胞皺縮變形且貼壁能力下降。經DAP作用后CIAFLS細胞活力明顯下降，并與DAP作用濃度呈劑量依賴性。當DAP濃度為40 mg/L時，CIA-FLS細胞活力在50%左右，故后續實驗選擇此濃度繼續研究。

3.2 DAP對CIA-FLS中caspase基因的影響如表1所示，經DAP（終濃度為40 mg/L）作用48 h后，與對照組相比，CIA-FLS的caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA相對表達量明顯增加（P＜0.05）。由此可見，DAP可以激活CIA-FLS的caspase通路。

表1 DAP對CIA-FLS中caspase基因mRNA相對表達量的影響/±s

表1 DAP對CIA-FLS中caspase基因mRNA相對表達量的影響/±s

組別對照組DAP組F值P值caspase-3 1.00±0.00 3.07±0.43 69.47 0.001 caspase-8 1.00±0.00 1.67±0.09 171.29＜0.001 caspase-9 1.00±0.00 2.35±0.20 131.85＜0.001

3.3 caspase抑制劑不同條件預處理后，DAP對CIA-FLS增殖的影響與單獨DAP作用組相比，各caspase抑制劑預處理均在不同程度上影響DAP抑制CIA-FLS增殖的效應。當Casp3-In、Casp9-In濃度為5 μmol/L，Pancasp-In濃度為20 μmol/L，預處理CIA-FLS 2 h或4 h，均可明顯提高CIA-FLS細胞活力；當Casp8-In濃度為5 μmol/L時亦可在一定程度上提高CIA-FLS細胞活力，但不如Casp3-In、Casp9-In、Pancasp-In效果明顯，而當Casp8-In濃度為20 μmol/L時，CIA-FLS細胞活力卻低于單獨DAP作用組。見圖2。

3.4 DAP對CIA-FLS凋亡形態的影響根據CCK-8實驗和初期預實驗，選擇Casp3-In、Casp8-In、Casp9-In濃 度 為5 μmol/L，Pancasp-In濃 度 為20 μmol/L，預處理CIA-FLS 2 h，再與DAP（終濃度為40 mg/L）共處理48 h。如圖3所示，對照組細胞核呈彌散均勻的藍色熒光，細胞排列均勻，未見明顯的凋亡熒光；DAP組細胞核形狀大小不一，出現較多濃染致密的顆粒狀、塊狀熒光，細胞核固縮、碎裂明顯，細胞數量明顯少于對照組；Casp3-In、Casp9-In、Pancasp-In預處理組，呈均勻藍色熒光的正常細胞核較DAP組明顯增多，但仍可見到少量散在分布的顆粒狀熒光，少數細胞核碎裂；Casp8-In預處理組與DAP組差異不明顯，細胞數量較少。

3.5 DAP對CIA-FLS凋亡率的影響與對照組相比，經DAP作用后CIA-FLS凋亡率明顯升高［（34.80±3.90）%比（5.68±1.35）%，P＜0.05］；各caspase抑制劑預處理組CIA-FLS凋亡率均明顯低于DAP組（P＜0.05）；各caspase抑制劑預處理組中，Casp8-In預處理組CIA-FLS凋亡率明顯高于Casp3-In、Casp9-In、Pancasp-In預 處 理 組［（29.46±2.16）%比（18.09±2.50）%、（20.41±3.53）%、（10.17±1.91）%，P＜0.05］。

4 討論

FLS異常增生引發的持續性滑膜炎癥和軟骨破壞，是RA最顯著的病理特征［10］。研究表明FLS具有類腫瘤樣增殖和抗凋亡的特性，增生活化的FLS產生多種促炎細胞因子與基質破壞性酶類，促進了FLS侵襲和破壞關節［11］。目前尚無根治RA的方法，臨床上常用的治療藥物包括非甾體抗炎藥、免疫抑制劑、糖皮質激素等，雖然具有明顯對癥及抗炎效果，但相應毒副作用大，不適合長期使用；新興生物靶向制劑如利妥昔單抗，具有一定療效，但價格昂貴且僅對部分難治性RA有效［12］。天然植物來源的活性單體藥物，具有來源廣泛、易于獲得、價格相對低廉、作用靶點多等優勢，在臨床應用方面日益受到關注，也是人類從自然界獲取新藥的重要途徑［13］。既往文獻報道中國傳統中藥活性成分如雷公藤多苷［14］、姜黃素［15］、白藜蘆醇［16］、青藤堿［17］等，治療RA病人或關節炎大鼠表現出較好療效，極大拓展了學者們對RA的研究思路。鑒于FLS存在異常增生和凋亡不足的特性，利用中藥活性單體成分干預來抑制FLS增殖、誘導其凋亡，有望成為一種治療RA行之有效的臨床方案［18］。

細胞凋亡是一種高度有序、受基因精細調控以及一系列酶參與的細胞自主性死亡方式，caspase家族是其中非常關鍵的調控因子。根據caspase在凋亡通路所處位置及執行功能的不同，可將其分為兩大類，第一類是凋亡啟動因子（包括caspase-2/8/9/10），第二類是凋亡效應因子（包括caspase-3/6/7）［19］。細胞凋亡主要有兩條經典的介導通路，分別是死亡受體途徑和線粒體途徑。死亡受體途徑中，死亡受體與相應配體結合后發生多聚化，募集FADD，再與caspase-8結合，形成死亡誘導信號復合體，活化procaspase-8，激活下游效應caspase-3，導致細胞凋亡［20］。線粒體途徑由細胞內死亡信號如病毒、射線、化療藥物等激活，使線粒體膜通透性增加，造成Cyt-c等釋放入胞質，在ATP/dATP存在情況下，Cyt-c與Apaf-1等結合形成多聚復合體，活化procaspase-9，激活下游效應caspase-3，導致細胞凋亡［21］。由此可見，caspase-8、caspase-9分別是兩條凋亡途徑的上游啟動因子，而caspase-3是凋亡途徑末端共同的效應因子。caspase貫穿這兩條途徑的始終，使其互相聯系、彼此影響，共同調節細胞凋亡過程。為此，本研究重點聚焦于caspase通路來探討DAP對CIA-FLS增殖與凋亡的影響。

本研究首先明確DAP對CIA-FLS增殖的影響，結合倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態和CCK-8試驗，證實DAP能以劑量依賴性的方式降低CIA-FLS細胞活力，抑制其增殖。此外，DAP促使CIA-FLS的caspase相關基因表達增加，說明這個過程中caspase通路激活。當采用不同caspase抑制劑預處理CIAFLS后，DAP的抑制作用不同程度減弱，這與caspase抑制劑的種類、濃度、預處理時間均存在關聯，特別是抑制劑種類。細胞發生凋亡時會出現一系列形態學變化，如細胞核碎裂、細胞質濃縮等，本研究利用Hoechst 33258熒光染色觀察到CIA-FLS呈均勻彌散熒光，而經DAP作用后CIA-FLS細胞核形態發生明顯改變，出現較多典型的凋亡熒光，Casp3-In、Casp9-In、Pancasp-In預處理組的凋亡現象較DAP組有不同程度改善。因此，我們推測DAP可能通過誘導CIA-FLS凋亡，從而抑制其增殖，這一過程中caspase通路起著重要作用。

為了進一步明確DAP誘導CIA-FLS凋亡的特性，并探討其主要參與哪條凋亡途徑，本研究還采用雙染流式細胞術檢測CIA-FLS凋亡率，發現各caspase抑制劑預處理組凋亡率較DAP組均明顯降低，以Pancasp-In預處理組降低最為明顯，但Casp8-In預處理組凋亡率卻明顯高于其他抑制劑預處理組。不難看出，通過熒光染色觀察到的凋亡情況與流式檢測結果基本一致，DAP可誘導CIA-FLS發生明顯凋亡改變。當抑制caspase通路后，可有效阻斷DAP誘導CIA-FLS凋亡的效應，并且抑制線粒體途徑的凋亡啟動因子對凋亡阻斷效果，明顯優于抑制死亡受體途徑的凋亡啟動因子，說明線粒體途徑在這一過程中起著重要作用。文獻報道［22］RA病人的FLS在線粒體凋亡途徑中，可出現多種方式抵抗相關受體介導的凋亡，包括Bcl-2家族蛋白的功能失調、NF-κB信號轉導通路失調、p53突變等，表明線粒體凋亡途徑是FLS出現凋亡抵抗的重要原因，亦是天然藥物誘導FLS凋亡的重要潛在靶點。

綜上所述，本研究發現DAP可呈劑量依賴性地抑制CIA-FLS增殖，并通過caspase依賴的途徑誘導CIA-FLS發生凋亡，其中主要涉及線粒體凋亡途徑，表明DAP有望作為治療RA的一種天然候選藥物。值得注意的是，caspase通路涉及的調控基因眾多，以及其他少見凋亡通路的存在，如內質網凋亡通路［23］、非caspase依賴的凋亡通路［24］，故仍有待于我們后續的實驗研究來進一步剖析DAP誘導CIA-FLS凋亡的精細機制，特別是線粒體途徑中具體作用的分子靶位。