荷蘭馬齒莧種子脂肪酸活性成分的分析

劉圓圓，孫宇飛，趙承曉，趙蕊，于永忠

作者單位：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319

馬齒莧（Portulaca oleracea L.；Purslane）是馬齒莧科馬齒莧屬的一年生草本植物。在《中國藥典》和世界衛(wèi)生組織（WHO）提倡的“地中海式飲食”的膳食指南中均認定馬齒莧為藥食兩用植物［1］。馬齒莧廣泛分布于除高寒地區(qū)的外溫帶和亞熱帶地區(qū)［2］，適應(yīng)環(huán)境能力極強［3］且耐鹽堿［4］。馬齒莧全草均可入藥，有清熱利濕、消腫解毒、消炎［5］利尿等功效。研究表明，馬齒莧除了包含多種營養(yǎng)物質(zhì)如去甲腎上腺素、胡蘿卜素、多糖和黃酮，還具有多種有效成分如不飽和脂肪酸［6-7］，以及維生素A和維生素E，被譽為“天然抗生素”之一。1995年，我國首次試驗種植荷蘭馬齒莧。2008年，在北京奧運會期間專供各國運動員食用的奧運蔬菜。隨即全國開始種植，形成規(guī)模種植的部分地區(qū)有山東壽光，浙江麗水，河南商丘，湖北武漢等等。2012年，我們從國家蔬菜工程技術(shù)研究中心（京研）引進荷蘭馬齒莧，在黑龍江省大慶市試驗種植并加以改良，獲得了適合當(dāng)?shù)氐呢S產(chǎn)品種，在產(chǎn)量、品質(zhì)等方面均優(yōu)于野生品種，但在有效成分含量及功效方面有待于深入研究。

馬齒莧種子中的天然脂肪酸種類蘊含豐富，其中主要包括單不飽和脂肪酸（如油酸、棕櫚酸等）和多不飽和脂肪酸（如ɑ-亞麻酸、亞油酸等）。從分子構(gòu)成上講，多不飽和脂肪酸又分為ω-3多不飽和脂肪酸及ω-6多不飽和脂肪酸。ω-3不飽和脂肪酸經(jīng)體內(nèi)轉(zhuǎn)化為二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），主要作用是降低血管中膽固醇含量，保護心血管健康［8］、阻止腸道疾病的發(fā)生［9-11］以及輔助精神病［12］和癌癥的治療［13］。由于人體不能合成ω-3不飽和脂肪酸，需從天然食物中獲取。自然界含ω-3不飽和脂肪酸豐富的動植物有深海魚類和油料作物等，相比之下，馬齒莧不飽和脂肪酸的獲取要比深海魚類和一些動植物等來源方便、價格低廉。基于馬齒莧ω-3多不飽和脂肪酸的開發(fā)利用價值，越來越多的國內(nèi)外研究學(xué)者不斷探索其提取工藝，目前已有物理壓榨法［14］、超臨界二氧化碳提取法［15］、超聲提取法［16］、化學(xué)溶劑浸提法［17］和生物酶法［18］等。此前，有數(shù)據(jù)表明，馬齒莧中的ω-3不飽和脂肪酸含量占總脂肪酸的16.9%［13］。為探究荷蘭馬齒莧的情況，本研究自2020年6―11月對荷蘭馬齒莧種子脂肪酸進行了提取、鑒定與對比分析。

1 材料和方法

1.1 材料荷蘭馬齒莧種子來源于天然藥物功能研究實驗室，經(jīng)黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)引進并人工種植培育的荷蘭馬齒莧，精心挑選出莖稈壯實且枝葉肥厚的優(yōu)質(zhì)荷蘭馬齒莧采摘收集種子。

1.2 主要試劑和儀器分析級甲醇、石油醚、三氟化硼（BF3）、正己烷（德州潤昕實驗有限公司）；37種脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品（青島科創(chuàng)質(zhì)量檢測有限公司）；內(nèi)標(biāo)十九烷酸甲酯（sigma公司）；Trace1310ISQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國賽默飛世爾科技）；干熱烘箱（上海森信實驗儀器有限公司）；中藥材粉碎機（江陰市寶利機械制造有限公司）；索氏提取器（上海極恒實業(yè)有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 荷蘭馬齒莧種子粉的制備采集約1 kg的荷蘭馬齒莧種子，洗滌后置于干燥箱中烘干水分，用中藥材粉碎機粉碎成種子粉裝瓶備用。

1.3.2 脂肪酸的提取取凈重78 g的種子粉末放入裝有石油醚的索氏提取器中，啟動加熱裝置使石油醚不斷回流浸提。浸提結(jié)束后，回收石油醚，烘干后放入干燥器內(nèi)冷卻。重復(fù)以上操作直到提取物恒重，得荷蘭馬齒莧種子油。上述實驗重復(fù)3次，計算荷蘭馬齒莧種籽的出油率。之后，將粗提物樣品委托青島科創(chuàng)公司進行定量分析檢測。

1.3.3 脂肪酸分析檢測

1.3.3.1 樣品處理將粗提物樣品稱重放入到離心管中，加入氫氧化鈉-甲醇溶液；以十九烷酸甲酯做內(nèi)標(biāo)，將離心管水浴后，等溫度降到室溫，加入三氟化硼-甲醇溶液，水浴冷卻后用適量正己烷萃取，取正己烷層過膜上機。

1.3.3.2 色譜分析本實驗選擇TG-5MS（30 m×0.25 m×0.25 μm）色譜柱，加熱程序為：80℃，1 min，以10℃/min速率到200℃，以5℃/min的速率升到250℃，又以2℃/min速率升到270℃，停留檢測。其中進樣口溫度為290℃，載氣流速為1.2 μL/min，采取不分流進樣，開閥時間為1 min。質(zhì)譜條件為離子源溫度280℃，傳輸線溫度280℃，溶劑延遲時間5 min，掃描領(lǐng)域擴大為30～400 amu，離子源為EI源，70 eV。

2 結(jié)果

2.1 荷蘭馬齒莧種子及其油脂產(chǎn)率荷蘭馬齒莧葉片較大且肥厚，莖稈粗壯直立，果實邊成熟邊開裂，極容易散落在周圍土壤中生長出新的植株，荷蘭馬齒莧種子呈黑色圓餅狀，粒徑雖小但產(chǎn)量較大，平均每株植株產(chǎn)種子數(shù)約14 400粒，千粒種子約重0.48 g，發(fā)芽力保持持久。經(jīng)過索氏提取法提取的荷蘭馬齒莧種子油，呈淡黃色半透明油狀，具有植物油的芳香味。經(jīng)計算出油率為（20.36±0.12）%。

2.2 荷蘭馬齒莧種子脂肪酸的組成和相對含量經(jīng)甲酯化得出來的荷蘭馬齒莧總脂肪酸運用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析，共檢測出6種主要成分。其不飽和脂肪酸組成如表1所示。各脂肪酸質(zhì)譜圖如圖2所示。

圖2 荷蘭馬齒莧種子脂肪酸質(zhì)譜分析結(jié)果：A為棕櫚酸；B為硬脂酸；C為α-亞麻酸；D為順-11-二十碳烯酸；E為山崳酸；F為亞油酸

表1 GC-MS分析荷蘭馬齒莧不飽和脂肪酸組成

各色譜對應(yīng)峰值經(jīng)過質(zhì)譜圖庫檢索定性分析，按照數(shù)理統(tǒng)計的方法，確定荷蘭馬齒莧種子中的各脂肪酸成分含量的相對百分比情況，可以得出α-亞麻酸、亞油酸以及硬脂酸之間的相對百分含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義。此外，我們比較了兩種馬齒莧種子中脂肪酸成分。比較結(jié)果見表2。羅馬尼亞馬齒莧種子脂肪酸［7］的n-6與n-3比值為1.78，而荷蘭馬齒莧種子脂肪酸的n-6與n-3比值為3.76。

表2 兩種馬齒莧種子中脂肪酸成分比較/%

2.3 荷蘭馬齒莧籽油多不飽和脂肪酸含量豐富本實驗還比較了荷蘭馬齒莧籽油中脂肪酸的組分與其他幾種常見類型植物油之間的差異。荷蘭馬齒莧籽油含α-亞麻酸和亞油酸n-6與n-3的比值為3.76（表3）。

表3 14種植物籽油脂肪酸相對含量的比較/%

3 討論

本實驗采用索氏提取法對荷蘭馬齒莧種子脂肪酸進行提取，并對粗提物進行氣相色譜-質(zhì)譜檢測分析。截至目前，已有多種提取植物種子油的方法，也有多種方法混用的（如核桃油是先通過萃取器再經(jīng)過壓榨機榨取的［14］）。單一方法技術(shù)提取效率也很高，比如金銀花種子通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲提取［20］；元寶楓種仁油通過水酶法提取［21］。但是由于荷蘭馬齒莧的種子太小，不適合用物理壓榨法提取；雖然也有采用響應(yīng)面分析法提取的，但主要是為了獲取馬齒莧中的多糖成分［22］；而水酶法提取率較低且在待檢過程中要保持乳化體系的穩(wěn)定性，否則一旦形成穩(wěn)定的乳狀液，要破壞其穩(wěn)定性，達到分離相十分困難。綜合判斷，本實驗選用索氏提取法，以石油醚作為提取劑，使實驗不僅操作簡單，而且提高了脂肪酸提取率，也減少雜質(zhì)成分干擾。

荷蘭馬齒莧種子，經(jīng)過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測分析，發(fā)現(xiàn)與Stroescu所提取的羅馬尼亞馬齒莧種子脂肪酸組成成分差異明顯（表2），反映在α-亞麻酸的檢出率方面差異極明顯。結(jié)果表明，荷蘭馬齒莧種子中不含反油酸且油酸的含量極低，但亞油酸的相對百分含量較高，我們分析可能是由于馬齒莧在不同環(huán)境下生長造成了這種差異性。盡管如此，針對荷蘭馬齒莧種子脂肪酸成分定量分析仍需要多批次重復(fù)驗證。應(yīng)當(dāng)考慮到種子批次、營養(yǎng)條件、收集處理方法等客觀因素的影響，因此，需要進行多因素的統(tǒng)計學(xué)分析如多元回歸分析以最終評價。

總之，本實驗采用索式提取法提取荷蘭馬齒莧種子脂肪酸，提取率為（20.36±0.12）%；獲得的不飽和脂肪酸種類較多且占脂肪酸總量的94%以上。脂肪酸產(chǎn)物經(jīng)計算n-6與n-3的比值為3.73，貼近我國營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（中國營養(yǎng)學(xué)會建議成人脂肪攝入n-6、n-3比例為4∶1～6∶1為宜）。后續(xù)研究將圍繞荷蘭馬齒莧功能進行深入探索。本研究證明有機培植的荷蘭馬齒莧在食品、藥品、保健品以及動物飼料等方面都具有廣闊的開發(fā)利用前景。