新一代測序技術對22q11.2微缺失所致的胎兒心臟發育畸形的產前篩查價值

鄒玥，劉穎，郭雪華

作者單位：吉林省婦幼保健院中心實驗室，吉林 長春 130000

胎兒心臟發育畸形是臨床常見的先天畸形類型，據報道［1］，心臟發育畸形在胎兒期的發生率約為0.3%～1.4%，因心臟發育畸形導致的妊娠終止率可高達75%，其存活率僅有10%～38%，存活患兒經治療后也有部分預后不良，影響身體健康。胎兒心臟發育畸形受遺傳、環境等多因素影響，近年來研究發現［2］，染色體22q11.2微缺失與胎兒心臟發育畸形關系密切，染色體22q11.2微缺失病例中有60%～80%病例合并心臟發育畸形。臨床對22q11.2微缺失所致的胎兒心臟發育畸形尚無有效治療方法，因此進行產前早期篩查診斷對降低死胎率和活產兒心臟畸形率非常重要。目前微陣列比較基因組雜交技術（array comparative genomic hybridization，arrayCGH）是替代傳統分析細胞核型的有效工具，無需細胞培養即可高分辨準確檢測出染色體微缺失，但價格高、難度大，而近幾年臨床應用較多的多重連接探針擴增技術（multiplex ligation probe amplification，MLPA）雖花費較少，操作簡單，但該方法與arrayCGH均需行羊水穿刺采集樣本，會增加早產、宮內感染、宮內死亡的風險，孕婦及家屬接受度不高，不適用于產前篩查［3-4］。近年來新一代測序技術打破了傳統產前診斷的局限性，該技術包括大規模平行測序、焦磷酸測序、Illumina測序等多種方法，具有低成本、高通量、無創傷的特點，在胎兒遺傳病基因檢測和生殖篩查中優勢顯著［5］，但目前該技術在22q11.2微缺失所致的胎兒心臟發育畸形中的應用及診斷效能尚未有研究報道。鑒于此，筆者選取78例可疑胎兒心臟發育畸形者的孕婦采用新一代測序技術進行產前檢測，分析其篩查價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料按下述入排標準選取吉林省婦幼保健院2018年7月至2020年3月可疑胎兒心臟發育畸形的孕婦78例作為受試對象，年齡范圍為23～41歲，年齡（28.43±4.27）歲；孕齡范圍為12～24周，孕齡（18.94±2.86）周；其中自然受孕者65例；既往有唇裂、無腦兒、心臟缺陷、智力缺陷、死胎等異常生育史者18例；有家族遺傳史者2例。本研究已經吉林省婦幼保健院倫理委員會批準（201806-002）。

納入標準：（1）經超聲檢查疑似胎兒心臟發育畸形者；（2）均為單胎妊娠；（3）均接受跟蹤隨訪；（4）均對本研究知情并簽署同意書。排除標準：（1）妊娠期有糖尿病、高血壓等合并癥者；（2）既往有高血壓、糖尿病者；（3）接受過輸血、細胞治療、移植手術者；（4）過度肥胖者；（5）心、肝、腎等功能異常者。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及處理（1）羊水穿刺及DNA提取：告知孕婦及家屬羊水穿刺風險，孕婦需簽署同意書。進行穿刺前需行血常規、凝血常規、傳染病檢查、超聲檢查，在無感染、無發熱、凝血功能正常、羊水量充足的情況下進行羊水穿刺。穿刺后取羊水樣本，離心后棄去上清液，采用游離DNA提取試劑盒（上海希言科學儀器有限公司）按照操作流程提取胎兒脫落細胞中的DNA。（2）外周血DNA提取：采集孕婦及其配偶的外周血于抗凝管中保存，在4℃、10 000 r/min（離心半徑12 cm）條件下離心10 min，后取上層血漿，采用游離DNA提取試劑盒（上海希言科學儀器有限公司）按照操作流程提取游離DNA。

1.2.2 新一代測序技術檢測用Nanodrop2000核酸定量儀（美國Nanodrop）測定提取的孕婦外周血游離DNA的純度和濃度，檢測合格后于-20℃冰箱保存。游離DNA經文庫制備后在Illumina Next-Sep500測序平臺完成100 kb、測序深度1×的高通量測序，將測序結果經信息分析通過Z值進行染色體22q11.2缺失基因判定。

1.2.3 MLPA技術檢測采用微缺失檢測試劑盒（荷蘭MBC-Holland）按照操作流程進行檢測，共含22q11.2區域的29個探針，稀釋提取的羊水DNA濃度后進行變性、雜交、連接反應，取連接產物進行PCR反應，過程：95℃、60℃下各30 s，72℃下1 min，35個循環后在72℃下延伸10 min。然后取反應產物在ABI3130基因分析儀中進行電泳，采用Coffalyser軟件進行分析得出基因相對拷貝數比值：比值＜0.7表示檢測區基因有缺失；比值為0.7～1.3，表示檢測區基因無缺失；比值＞1.3表示檢測區基因有重復片段。采集檢測結果有22q11.2缺失的孕婦及配偶外周血，提取外周血DNA采用MLPA技術檢測胎兒父母有無22q11.2微缺失，以進行父母溯源。

1.2.4 arrayCGH技術檢測采用Oligo Human CGH Microarray芯片（美國Agilent公司），經過洗滌、離心甩干后對采集提取的孕婦羊水DNA進行全基因組掃描分析22q11.2精確缺失位置和大小。

1.2.5 跟蹤隨訪跟蹤隨訪至孕婦妊娠結束，引產或死產者進行尸檢觀察胎兒心臟發育畸形情況，活產者進行心臟檢查觀察發育情況，統計胎兒心臟發育畸形結果。將arrayCGH驗證結果記作診斷22q11.2微缺失所致的胎兒心臟發育畸形的“金標準”。

1.3 觀察指標（1）隨訪結果；（2）新一代測序技術檢測胎兒22q11.2微缺失情況；（3）MLPA技術檢測胎兒及其父母22q11.2微缺失情況；（4）arrayCGH技術驗證情況。

1.4統計學方法采用SPSS 25.0軟件作為統計學工具。采用配對χ2檢驗方法比較各診斷方法與金標準方法的診斷價值，采用Kappa一致性檢驗分析不同方法與“金標準”結果的一致性，P＜0.05為檢測水平差異有統計學意義。

2 結果

2.1 隨訪情況共35例胎兒心臟發育畸形，發生率為其中永存動脈干、右心室雙出口2例，共同動脈干、雙上腔靜脈、共同房室瓣反流3例，大動脈轉位、單心室、三尖瓣閉鎖3例，肺動脈閉鎖、室間隔缺損3例，單心房、單心室、完全性心內膜墊缺損2例，肺動脈狹窄、室間隔缺損、主動脈騎跨5例，室間隔缺損、肺動脈狹窄、右位主動脈弓5例，室間隔缺損、動脈導管缺如、右位主動脈弓4例，室間隔缺損、動脈導管缺如4例，室間隔缺損、右位主動脈弓2例，法洛四聯癥、肺動脈閉鎖2例。

2.2 新一代測序技術結果35例胎兒心臟發育畸形中有12例經新一代測序技術發現22q11.2微缺失，檢出率為34.29%（12/35）；43例胎兒心臟發育正常中有1例經新一代測序技術發現22q11.2微缺失，檢出率為2.33%（1/43）。（即新一代測序技術發現了13例陽性樣本-22q11.2微缺失）。

2.3 MLPA檢測結果35例胎兒心臟發育畸形中有14例經MLPA發現22q11.2微缺失，檢出率為40.00%（14/35）；43例胎兒心臟發育正常中有1例經MLPA發現22q11.2微缺失，檢出率為2.33%（1/43）。（即MLPA方法發現了15例陽性樣本22q11.2微缺失）。

此外，15例發現22q11.2微缺失的胎兒父母基因溯源發現有2例父源22q11.2微缺失，占比為13.33%（2/15）；余13例父母檢測結果均正常。

2.4 arrayCGH技術驗證結果

2.4.1 14例胎兒心臟發育畸形22q11.2微缺失的檢測結果35例胎兒心臟發育畸形中有14例經arrayCGH檢測發現22q11.2微缺失，檢出率為40.00%（14/35），具體信息見表1。

表1 14例胎兒心臟發育畸形22q11.2微缺失的檢測結果

2.4.2 1例胎兒心臟發育正常22q11.2微缺失的檢測結果43例胎兒心臟發育正常中有1例經arrayCGH檢測發現父源22q11.2微缺失，MLPA檢測缺失范圍為LCR A-D，arrayCGH檢測22q11.2微缺失范圍為19187939-21464479，2.27Mb，檢出率為2.33%（1/43）。

2.4.3 新一代測序技術診斷22q11.2微缺失情況的診斷分析結果（1）胎兒心臟發育畸形者經新一代測序技術檢測22q11.2微缺失檢出率，均高于胎兒心臟發育正常者。診斷價值分析（配對χ2檢驗）發現：新一代測序技術檢測與金標準arrayCGH驗證法的關聯性χ2=59.43，P=0.000（提示兩法關聯），差異性χ2=0.50，P=0.480（提示兩法相近），靈敏度0.87，特異度1.00。其符合率（準確度）為97.4%（76/78）、Kappa=0.910（提示一致性好），見表2。

表2 新一代測序技術診斷22q11.2微缺失情況/例

（2）胎兒心臟發育畸形者經MLPA檢測22q11.2微缺失檢出率，均高于胎兒心臟發育正常者。診斷價值分析（配對χ2檢驗）發現：MLPA檢測22q11.2微缺失情況與金標準arrayCGH驗證法的關聯性χ2=71.70，P=0.000（提示兩法關聯），差異性χ2=0.00，P=1.000（提示兩法相同）。其符合率（準確度）為100.0%（76/78）、Kappa=1.000（提示兩法完全一致），見表3。

表3 MLPA診斷22q11.2微缺失情況/例

3 討論

染色體22q11.2微缺失是最常見的引起胎兒心臟發育畸形的遺傳因素之一，因其為顯性遺傳，攜帶者下一代發生22q11.2微缺失的概率較大［6］，因此產前篩查22q11.2微缺失意義重大。近年來隨著基因組學的技術進步，臨床上采用MLPA、arrayCGH等技術進行22q11.2微缺失的檢測，但檢測過程均具有創性，對宮內胎兒發育有潛在危險，不適用于產前篩查。因此，亟須尋求一種安全、有效、簡便的方法來進行22q11.2微缺失產前篩查，預防新生兒出生缺陷。

本研究發現，在78例可疑胎兒心臟發育畸形的孕婦中有35例確診胎兒心臟發育畸形，胎兒心臟發育畸形易造成孕期流產、死胎、新生兒早期死亡等，因此需高度重視胎兒心臟發育畸形產前篩查。本研究35例胎兒心臟發育畸形者經新一代測序技術檢測發現有12例22q11.2微缺失，檢出率為34.29%，43例胎兒心臟發育正常者經新一代測序技術發現有1例22q11.2微缺失，檢出率為2.33%，說明新一代測序技術對22q11.2微缺失有一定的篩查作用。研究發現［7-8］，妊娠5周后就可在母體外周血中檢測出胎兒DNA，并且其濃度隨孕期增加而升高，且妊娠后血漿胎源性DNA分子長度顯著短于母體，因此從母體外周血血漿中提取胎兒DNA比較簡便。

本研究采用Illumina新一代測序技術對母體外周血提取的胎兒DNA進行大規模深度測序，在DNA復制時加入標記核苷酸進行追蹤捕獲目的基因組，利用Illumina平臺邊合成邊測序，覆蓋基因范圍廣泛，具有較高的敏感度和準確性，且操作方法簡單，對宮內胎兒發育無影響［9］。Gatticchi等［10］在對由2ALMS1基因變異引起的Alstr?m綜合征病人進行基因篩查診斷研究中，發現新一代測序技術能夠快速、準確進行篩查診斷，進一步證實了新一代測序技術在基因篩查診斷中的價值。既往研究報道［11-12］，MLPA技術在基因變異導致的各種疾病中有較高的檢測價值。本研究中35例胎兒心臟發育畸形中有14例經MLPA發現22q11.2微缺失，檢出率為40.00%，43例胎兒心臟發育正常中有1例經MLPA發現22q11.2微缺失，檢出率為2.33%；其中15例22q11.2微缺失的胎兒父母基因溯源發現有2例父源22q11.2微缺失，占比為13.33%，余13例父母檢測結果均正常，說明了MLPA技術對22q11.2微缺失具有檢測診斷價值。MLPA技術將DNA探針技術與PCR技術結合，能夠高通量快速檢測基因組拷貝數變異，準確識別缺失區域，且能對父母溯源，有助于遺傳咨詢，評估再次孕育風險，常用于檢測臨床基因遺傳疾病［13］。另外本研究結果顯示，經arrayCGH技術檢測驗證，35例胎兒心臟發育畸形中有14例發現22q11.2微缺失，檢出率為40.00%，43例胎兒心臟發育正常中有1例發現22q11.2微缺失，檢出率為2.33%。arrayCGH技術能夠進行基因組拷貝數變異分析，對檢測微小缺失具有獨特優勢，檢測結果準確、可靠，臨床常采該技術驗證其他基因測序技術檢測結果［14］。

本研究結果顯示胎兒心臟發育畸形者經一代測序技術、MLPA技術檢測22q11.2微缺失檢出率均高于心臟發育正常者，提示22q11.2微缺失與胎兒心臟發育畸形有密切關系。大量研究發現，染色體22q11.2區域有較多低拷貝重復序列，易發生非等位基因同源重組，影響胚胎早期心臟形態發生及心血管的發育，主要導致圓錐動脈畸形，如法洛四聯癥、主動脈離斷、房/室間隔缺損、永存動脈干、右室雙出口和大動脈轉位等［15-17］，故進行產前篩查胎兒22q11.2微缺失情況對降低新生兒心臟畸形率意義重大。本研究采用新一代測序技術檢測胎兒22q11.2微缺失情況結果與金標準arrayCGH驗證法具有高度一致性，采用MLPA檢測結果與金標準arrayCGH驗證法完全一致，且以上兩種檢測方法與金標準arrayCGH驗證法有顯著關聯性，無明顯差異性，檢測符合率高，說明新一代測序技術和MLPA技術對22q11.2微缺失的檢測準確度高，證實了新一代測序技術及MLPA技術的篩查價值。新一代測序技術相比傳統Sanger測序技術所需樣本量少、通量高、分辨率高，能檢測出低至0.1 Mb的缺失或重復［18］；與arrayCGH技術相比無需對全基因組測序，可利用序列捕獲技術針對性檢測目的基因組，節省成本，檢測速度快；與MLPA技術相比樣本要求簡單，可降低樣本污染風險，且無創傷性。因此，臨床可應用新一代測序技術作為22q11.2微缺失所致的胎兒心臟發育畸形的產前篩查方法。

綜上，22q11.2微缺失是胎兒心臟發育畸形的常見原因，新一代測序技術和MLPA對其篩查價值相當，可在臨床產前篩查中推廣應用。