共享外周循環對糖尿病腎病小鼠腎損傷的影響

黃 琪 周亦倫* 孫雪峰

(1.首都醫科大學附屬北京天壇醫院腎內科，北京 100050；2.中國人民解放軍總醫院腎內科 腎臟疾病國家重點實驗室，北京 100853)

糖尿病腎病(diabetic kidney disease, DKD)已經成為我國人群中慢性腎臟病的首位病因[1]，有效防治DKD不但是我國衛生經濟的重大需求，也是世界范圍的醫療難題。1990年至2010年間，美國糖尿病患者相關并發癥呈現明顯下降趨勢，其中糖尿病引起的急性心肌梗死、高血糖危象、卒中及截肢發生率下降達50%以上；遺憾的是，糖尿病腎病的發生率變化最小，20年來幾乎無明顯下降[2]。

DKD是遺傳與環境因素交互作用所致的復雜疾病，發病機制尚未完全闡明。強化胰島素治療可減少DKD發生進展；胰腺移植5～10年后DKD患者尿白蛋白、腎功能和腎組織病變都能恢復正常，提示代謝異常是DKD發生和進展的關鍵機制。但是僅僅30%～40%的糖尿病患者合并DKD，其他糖尿病患者盡管存在高血糖狀態卻不發生DKD，提示糖代謝異常并非DKD發生進展的唯一因素。但是，非糖代謝的代謝異常在DKD發生和進展中的研究不足，確切機制尚不明確；尚存在不同研究結果間差異性大，篩選出的代謝物質并非DKD特異而是廣泛表達于所有終末期腎病的情況[3]。

連體動物模型通過建立兩只動物間的微循環交通，實現連體動物間的血液細胞及可溶性因子的持續交換。該模型不但可以探討一個生物體內環境改變是否能夠引起疾病、衰老及表觀遺傳背景的變化，同時還可以探討一個生物體循環因素的改變(如疾病、衰老、飲食、運動等)是否會導致另一個年輕健康生物體的機體狀態發生相應變化。本課題組在前期研究[4]中發現，青年小鼠與老年小鼠連體后，老年小鼠腎臟衰老的相關指標明顯下降；與健康青年小鼠共享外周循環的老年急性腎損傷(acute renal injury, AKI)小鼠，其腎功能、炎癥、氧化應激等損傷指標明顯低于未連體對照組[5]。

連體動物模型同樣是DKD研究的理想模型。將野生小鼠分別與鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導的不同DKD進展期的小鼠構建連體模型，通過連體動物間血液循環，野生小鼠胰腺分泌的胰島素等代謝因子進入DKD小鼠體內調控物質代謝；DKD小鼠體內物質進入野生小鼠體內，利用野生小鼠的胰腺進行代謝調控，從而實現野生小鼠對DKD小鼠的外周循環支持。利用該創新動物模型，以野生小鼠為陰性對照，以STZ誘導的DKD小鼠為陽性對照，解析共享外周循環對DKD小鼠腎組織損傷的作用，以期形成DKD發生進展的代謝異常新理論。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及處理

C57BL/6J雄性小鼠由首都醫科大學附屬北京天壇醫院動物中心提供，動物許可證號：SCXK(京)2019-0010。所有實驗過程均獲得首都醫科大學附屬北京天壇醫院動物保護和利用委員會審批(審批號：202001002)。小鼠飼養在溫度(22±2)℃、濕度50%±5%的環境中，12 h∶12 h晝夜循環，自由進食水，采用隨機數字法將小鼠隨機分為3組，每組24只小鼠，各組處理如下。

(1)陽性對照組，即STZ誘導的糖尿病組：選擇8周齡的C57BL/6J雄性小鼠，禁食12 h，STZ(美國Sigma公司)一次性腹腔注射50 mg/kg，連續注射5 d。完成STZ注射后3 d，測定空腹血糖，選擇血糖高于16.7 mmol/L小鼠納入后續試驗。此后根據STZ注射后不同時間點細分為3組：①STZ注射后12周(DKD 12周,n=8)②STZ注射后20周(DKD 20周,n=8)③STZ注射后28周(DKD 28周,n=8)。

(2)陰性對照組：與陽性對照組處理類似，但將STZ更換為0.9%(質量分數)氯化鈉注射液(以下簡稱生理鹽水)注射8周齡C57BL/6J雄性野生型(wild type，WT)小鼠，同樣注射后根據不同時間分為3組：①生理鹽水注射后12周(WT 12周,n=8)②生理鹽水注射后20周(WT 20周,n=8)③生理鹽水注射后28周(WT 28周,n=8)。

(3)連體組，即STZ誘導的糖尿病小鼠與野生型小鼠連體組(parabiosis-DKD,para-DKD)：將8周齡C57BL/6J雄性小鼠分別與STZ注射后12、20及28周的DKD小鼠連體，3組分別為：①para-DKD 12周(n=8)②para-DKD 20周(n=8)③para-DKD 20周(n=8)。連體8周后處死動物，分別采集各組小鼠的血液、尿液和腎組織標本進行后續試驗。

1.2 構建連體模型

切開小鼠皮膚和皮下組織，分離供體小鼠胸部肌肉袢，縫合至受體小鼠胸部肌肉，并縫合2 只小鼠皮下組織和皮膚。通過相互縫合肌肉和皮下組織粘連生成的微血管再通，形成小鼠間血細胞和可溶性因子相互交換的共享循環系統。具體手術步驟參照之前的實驗過程[6]。

1.3 尿液、血液檢測

尿液采用代謝籠收集，用ELISA試劑盒測定尿白蛋白及尿肌酐。麻醉造模后12、20及28周的小鼠后，采用內眥采血法采血，采用全自動生化分析儀(日本日立公司7150型)測定小鼠血清血糖、胰島素、三酰甘油、總膽固醇。

1.4 組織病理

石蠟包埋的腎臟組織切片應用碘酸-雪夫(periodiz acid-Schiff，PAS)染色評價糖尿病腎病腎小球糖原沉積水平，進而明確糖尿病腎病腎小球硬化程度。Masson染色評估糖尿病腎病的纖維蛋白沉積，進而明確糖尿病腎病纖維化程度。

1.5 Western blotting法檢測蛋白含量

腎臟冰凍組織塊加入蛋白裂解液(RIPA∶PMSF為1∶100)100～300 μL，超聲破碎儀(美國Coleparmer公司)65%功率破碎至組織溶解，冰浴30 min，4 ℃離心機12 000 r/min離心30 min后，取透明上清液即蛋白。采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒(批號JK126465，美國Thermo Fisher公司) 測定蛋白濃度。向10%～15%(質量分數)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中加入60～100 μg總蛋白，再將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，1×酪蛋白于室溫封閉1 h，分別加入以下抗體于4 ℃孵育過夜：Ⅰ型膠原蛋白(collagen type Ⅰ， ColⅠ)(英國Abcam公司，批號ab260043)、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)(美國Cell Signaling Technology公司，批號3033)。再分別加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗小鼠IgG (美國Santa Cruz公司)，稀釋濃度為1∶1 000。增強化學發光法測定免疫反應條帶，用Quantity One軟件(美國Bio-Rad公司) 對條帶進行半定量分析。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 共享外周循環對DKD小鼠血糖及血脂影響

分別取不同時期陰性對照組、陽性對照組以及連體動物模型小鼠的血液進行血糖、胰島素、三酰甘油及總膽固醇檢測。血糖檢測結果顯示，與陰性對照組相比，陽性對照組小鼠在DKD 12周[(436.0±30.9)mg·dL-1vs(164.4±7.1)mg·dL-1]、DKD 20周[(510.3±32.5)mg·dL-1vs(170.2±4.9)mg·dL-1] 、DKD 28周[(508.7±31.6)mg·dL-1vs(168.4±8.3)mg·dL-1]血糖均明顯升高；與野生小鼠共享外周循環的DKD小鼠血糖明顯下降，介于陰性對照及陽性對照小鼠之間[DKD 12周：(260.6±15.9)mg·dL-1;DKD 20周：(278.6±18.5)mg·dL-1; DKD 28周:(269.5±16.2)mg·dL-1]，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。胰島素、三酰甘油及總膽固醇的檢測結果與血糖變化一致(表1)。

表1 3組小鼠在不同DKD時期血糖及血脂比較

2.2 共享血液循環對DKD小鼠腎功能影響

本文用尿白蛋白/肌酐(albumin-to-creatinine ratio，ACR)與陰性對照組相比，STZ誘導的糖尿病小鼠(陽性對照組)在DKD 20周時ACR開始增高，DKD 28周時進一步升高，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)；而連體后擁有共享外周循環的小鼠DKD 20周ACR無明顯升高(36.5±3.3vs55.4±3.2)，DKD 28周升高程度明顯低于陽性對照組(50.4±3.9vs79.6±4.9)(表2)。

表2 3組小鼠在不同DKD時期尿白蛋白/肌酐比較

2.3 共享外周循環減輕DKD小鼠腎臟病理損傷

陽性對照組小鼠自DKD 20周開始，腎臟腎小球體積及系膜區面積明顯增加；而連體模型提供健康外周循環的DKD 20周小鼠，其腎小球體積及系膜區面積均明顯減低(圖1)。腎小球、腎小管及腎間質纖維蛋白沉積情況與之相似，連體后的DKD 20周小鼠腎臟纖維化水平明顯低于陽性對照組DKD小鼠(圖1)。

圖1 DKD 20 周各組小鼠腎臟病理損傷情況

2.4 共享外周循環減輕DKD小鼠腎臟纖維化

檢測腎小球硬化及纖維化的相關標志物發現，與對照組小鼠相比，DKD 28周小鼠腎臟纖維化相關蛋白TGF-β1、ColⅠ的蛋白表達量明顯升高，而連體模型提供了共享外周循環的DKD小鼠腎臟上述蛋白表達量明顯低于陽性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見圖2。

圖2 纖維化標志物Col I及TGF-β1在DKD 28周各組小鼠腎臟的表達

3 討論

連體模型早在一百多年前就已建立，即通過外科血管吻合術把兩只動物的循環系統連接起來從而完成外周循環的交換。目前連體動物模型在多個領域均有應用，如循環、認知、干細胞、生殖及內分泌[7-9]。近年來有研究[10]顯示，利用連體動物模型提供外周循環可加快糖尿病小鼠皮膚愈合，也有學者[11]通過連體動物模型發現中樞神經系統來源的循環降糖因子。然而，連體動物模型在糖尿病腎病領域的研究較少，據此筆者建立野生型小鼠與DKD小鼠連體模型進行相關方面的研究。

在本研究中，STZ誘導的DKD小鼠隨著疾病進展，在持續性高糖及胰島素抵抗等因素作用下，在DKD 20周時出現腎小球體積增大、系膜基質累積、腎間質纖維化等腎組織損傷；而在持續的共享外周循環作用下，隨著DKD小鼠體內血糖濃度下降、胰島素敏感性升高，連體8周后其腎損傷明顯減輕，且纖維化相關分子標志物蛋白表達明顯減低。提示連體模型提供的持續共享體外循環可有效減緩DKD進展。

持續性高血糖和胰島素抵抗是誘發炎癥、氧化應激、組織損傷的重要因素，腎小球慢性炎癥可導致腎臟結構異常及纖維化，進而導致腎功能喪失。此外，提高胰島素敏感性可能對腎臟血管內皮細胞功能保護起重要作用[12]。在本項實驗中，連體提供的共享外周循環可能通過降低血糖、調節胰島素抵抗等方式減輕腎臟炎癥、氧化應激，從而減輕腎損傷。此外，本課題組既往研究[4]顯示，青年小鼠與老年小鼠連體后，老年小鼠腎組織自噬增強，炎癥、氧化應激及纖維化指標明顯下降，進一步利用細胞因子芯片對各組進行聚類分析，特異性地篩選出 6 種衰老相關的細胞因子，進一步應用篩選出的關鍵因子的基因修飾細胞和動物模型，明確解析了該關鍵因子的致病機制。同理，在本項研究中，可能存在某種(些)細胞因子通過共享循環途徑，作用于DKD小鼠腎臟，減輕腎損傷，該假設正在后續開展的實驗中進一步佐證。

脂代謝平衡對維持細胞的基本功能具有重要作用，為脂代謝異常參與了慢性腎小球疾病和腎小管間質性疾病的發生。脂代謝紊亂導致DKD發病的機制較為復雜，目前尚未完全明了。脂質可通過炎性反應、氧化應激、自噬、內質網應激和細胞凋亡等途徑導致足細胞損傷、細胞外基質增加和巨噬細胞浸潤[13-14]。脂肪酸與甘油酯化形成三酰甘油儲存于脂肪細胞中，并通過脂蛋白運輸入循環系統。DKD患者常伴有脂代謝紊亂，腎臟細胞內過量的游離脂肪酸及其代謝物(如脂肪酰輔酶A和神經酰胺)對腎小球內皮細胞和上皮細胞有直接損傷作用，也可加劇細胞損傷、炎性反應和纖維化的惡性循環。

膽固醇代謝異常也是DKD進展的重要原因之一?？偰懝檀紳舛壬呤荄KD 進展的危險因素之一，總膽固醇升高與大量蛋白尿之間存在相關性。DKD小鼠的腎臟皮質中有膽固醇的積累，DKD 患者的足細胞內也有膽固醇的沉積[15]。膽固醇沉積受到膽固醇攝取和合成增加，以及膽固醇流出或逆轉運減少等多個過程的影響。在本項研究中，自DKD 12周至28周，血清三酰甘油及總膽固醇濃度逐漸升高，伴隨ACR逐漸增多及腎組織損傷。相反，連體后的DKD小鼠，因存在持續性共享外周循環，其三酰甘油及總膽固醇濃度僅輕度升高，其DKD 28周時ACR濃度與陽性組DKD 20周持平。提示連體動物模型可能通過提供外周循環，調控DKD小鼠脂質代謝，最終減輕腎臟損傷。

總之，通過連體模型建立共享循環的方式，證實了共享外周循環可降低DKD小鼠的血糖濃度、增強其胰島素敏感性、調節脂質代謝，進而減輕腎臟組織損害，改善腎臟纖維化，保護腎功能。其中哪些循環因子發揮關鍵作用及其信號轉導機制，將在后續試驗中進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明黃琪：提出研究思路，設計研究方案，進行試驗，采集、分析數據，撰寫論文。周亦倫：總體把關、審定論文。孫雪峰：提出研究思路，設計研究方案。