保腎通絡方含藥血清調節線粒體自噬對高糖誘導下足細胞氧化損傷的影響

王夢迪 郭弋凡，2 龐彥余 劉羽飛,2 趙文景*

(1.首都醫科大學附屬北京中醫醫院腎病科，北京 100010；2.北京中醫藥大學，北京 100029)

糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病最嚴重的微血管并發癥之一，也是導致終末期腎臟病(end stage renal disease, ESRD)的重要病因[1]。如何有效延緩DKD進展是目前中西醫治療的瓶頸。蛋白尿是DKD的重要臨床特征之一，也是DKD患者腎功能進展的獨立危險因素，DKD患者一旦出現臨床水平蛋白尿，腎功能損傷將持續進展，進入ESRD的速度可達其他腎臟病變的14倍[2]。足細胞作為腎小球濾過屏障的重要組成部分，其損傷與蛋白尿的發生和DKD進展密切相關[3]。氧化應激在DKD發生和進展中的作用已被研究[4]證實，在糖尿病或高血糖狀態下，以活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)為主的活性分子生成增多，抗氧化物質減少，過量ROS在細胞內積聚，從而導致氧化應激。氧化應激可以通過多種途徑及信號通路損傷足細胞，引起足細胞凋亡、脫落等各種病理改變[5]。然而臨床研究[6]顯示，單純抗氧化治療在延緩DKD進展中的療效卻差強人意，因此有必要對足細胞氧化損傷機制進行深入研究。線粒體作為細胞ROS的主要來源，近年來在DKD發病中的作用引起了廣泛關注，其在足細胞氧化損傷中的作用值得進一步探討。本課題組前期臨床研究[7-8]表明，保腎通絡方能夠有效減少DKD患者尿蛋白、改善腎功能，在實驗研究[9]中也證實，保腎通絡方能夠有效減少糖尿病小鼠及高糖培養的足細胞損傷。本研究旨在觀察保腎通絡方含藥血清對高糖培養下足細胞氧化損傷的影響，并探討其對足細胞的保護作用與改善線粒體自噬的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株

永生化小鼠足細胞株MPC5，由首都醫科大學附屬北京中醫醫院劉寶利教授贈送，細胞來源于美國邁阿密大學Jochen Reiser教授。

1.1.2 藥物與試劑

保腎通絡方飲片(生黃芪、熟地黃、菟絲子、鬼箭羽、劉寄奴、水蛭、丹參)由首都醫科大學附屬北京中醫醫院中藥房提供。RPMI-1640無糖培養基(貨號11879-020，美國Gibco公司)、RPMI-1640含糖培養基(貨號11875-093，美國Gibco公司)、胎牛血清(貨號C04001-500，以色列Biological Industries公司)、干擾素-γ(interferon-γ,INF-γ)(貨號315-05-20，美國Pepro Tech公司)、PBS 緩沖液(貨號KGB5001，凱基生物)、CCK-8試劑盒(貨號CK04，日本同仁化學)、活性氧檢測試劑盒(貨號MAK145，美國Sigma公司)、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(貨號C2006，碧云天公司)、鬼筆環肽-FITC(貨號P5282，美國Sigma-Aldrich公司)、線粒體紅色熒光探針Mito Tracker?Red CMXRos(貨號8778P，美國Cell Signaling Technology公司)、Alexa Fluor 594驢抗兔IgG(貨號A32754，美國Invitrogen公司)、足細胞裂孔膜蛋白nephrin抗體ab216341，美國Abcam公司)、自噬相關蛋白5(autophagy-related protein 5，ATG5)抗體(貨號ab108327，美國Abcam公司)、ATG7抗體(貨號ab52472，美國Abcam公司)、微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)抗體(貨號ab19289，美國Abcam公司)、GAPDH抗體(貨號10494-1-AP，美國Proteintech公司)等。

33 ℃ CO2細胞培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)，37 ℃ CO2細胞培養箱(日本SANYO公司)、熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)、普通熒光顯微鏡(德國ZEISS公司)、激光共聚焦顯微鏡(日本Leca公司)、Western blotting 化學發光儀(美國Bio-Rad公司)、全自動酶標儀 MK3(美國Thermo公司)、流式細胞儀(美國Beckman coulter公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 含藥血清制備

選取雄性SPF級SD大鼠40只(動物倫理批件號:BUCM-4-2020121804-4173)，體質量為(180±20)g，數字表法隨機分為保腎通絡方組和空白對照組，分別用于制備含藥血清及空白血清，每組20只。其中保腎通絡方組按照20倍臨床劑量進行灌胃，空白組給予等體積蒸餾水灌胃，連續灌胃7 d。末次灌胃結束后2 h，1%(質量分數)戊巴比妥鈉按照40 mg/kg 劑量麻醉大鼠，腹主動脈取血，分離血清，56 ℃水浴30 min后無菌濾器過濾除菌，分裝凍存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 足細胞培養與分組

MPC5于含10%(體積分數)胎牛血清的RPMI-1640完全培養基中傳代，并于37 ℃、5%(體積分數) CO2的細胞培養箱內培養，待細胞到70%～80%融合時可用于實驗。具體分組如下：正常對照組(5.5 mmol/L葡萄糖+空白血清)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖+空白血清)、保腎通絡方組(30 mmol/L葡萄糖+保腎通絡方含藥血清)，然后進行細胞收集或固定，用于以下實驗，各組試驗均重復3次。

1.2.3 CCK-8法檢測足細胞活力

將MPC5以2 000個/孔接種至96孔板中，每孔100 μL，設置6個復孔，按上述分組分別培養48 h后加入10 μL/孔CCK-8反應液，于37 ℃孵育箱反應2 h，采用酶標儀檢測波長為450nm的吸光度值并按照說明書計算細胞活力。

1.2.4 鬼筆環肽染色

我現在只好用性的方式來證明我的愛，證明我對她有強烈的進取心。而這一點恰恰成了她嘲笑我的地方。她甚至在我們做愛的間隙，也對我的真誠表示出懷疑。她是這樣說的，你這么亢奮，是不是裝的？要不就是吃了偉哥？我大聲斥責說，我靠！你就這么埋汰我啊？我究竟哪點對不起你，讓你這么瞧不起我？白麗筠斜吊起眼睛瞥向天花板說，你跟你的姓葉的女朋友，是不是也這么嗨？我想起跟葉靄玲的交媾，遠沒有這么多的激情，但我沒有回答她。心想，你有什么權利過問我與葉靄玲的關系呢？要知道你自己曾經有過那么多的男人！

將MPC5以8 000個/孔接種到24孔板上，按上述方法分組培養48 h，吸棄培養基，PBS洗滌，4%(質量分數)多聚甲醛固定，0.2%(體積分數)TritonX-100透膜，3%(體積分數)驢血清封閉，鬼筆環肽-FITC 1 μg/mL染色，封片，避光4 ℃保存。熒光顯微鏡觀察和拍攝具有代表性的圖像。

1.2.5 免疫熒光

將MPC5以8 000個/孔接種到24孔板上，經上述方法分組處理48 h后，Mitotracker紅色熒光標志物標記線粒體，綠色熒光標記自噬蛋白LC3-Ⅱ，共聚焦激光顯微鏡觀察線粒體結構及LC3-Ⅱ與線粒體共標的表達情況。

1.2.6 流式細胞術

將MPC5以30 000個/孔接種于6孔板上，經上述方法分組處理48 h后，按照活性氧檢測試劑盒及JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒說明書步驟操作，收集細胞進行流式細胞儀分析。

1.2.7 Western blotting法檢測蛋白

將RIPA裂解液加入收集的足細胞中，冰上裂解30 min，離心后取上清，BCA法定量蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠，將等量的蛋白加入孔槽中電泳，電泳結束后將分離的蛋白轉移至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃搖床孵育過夜[LC3B(1∶2 000)、P62(1∶1 000)、ATG5(1∶2 000)、ATG7(1∶100 000)、Nephrin(1∶1 000)；GAPDH(1∶5 000)為內參]。洗膜，二抗搖床室溫孵育1 h，ECL試劑暗室內膠片曝光，顯影，Image J軟件分析各條帶的灰度值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 保腎通絡方含藥血清對高糖條件下足細胞活力的影響

CCK-8法檢測不同組別足細胞活力，采用不同高濃度葡萄糖(20～60 mmol/L)干預足細胞，結果表明，30 mmol/L高糖干預48 h足細胞活力明顯降低(P<0.05，圖1A)，與含10%(體積分數)胎牛血清培養基培養的足細胞比較，5%～12%的保腎通絡方含藥血清干預后足細胞活力差異無統計學意義(P>0.05，圖1B)。而繼續升高血清濃度，足細胞活力則顯著下降。進一步實驗結果顯示，與正常組相比，高糖組足細胞活力顯著降低，加入8%保腎通絡方含藥血清可明顯恢復高糖條件下足細胞活力(P<0.01，圖1C)。

圖1 不同濃度葡萄糖及保腎通絡方含藥血清對足細胞活力的影響

2.2 保腎通絡方含藥血清對高糖誘導的足細胞氧化損傷的作用

鬼筆環肽染色結果顯示，與正常組相比，高糖組足細胞骨架褶皺呈多邊形，應力纖維束被破壞，保腎通絡方含藥血清能夠恢復正常的細胞骨架(圖2A)。流式細胞術檢測各組足細胞ROS水平，結果顯示，與正常組相比，高糖組足細胞ROS水平顯著升高，保腎通絡方含藥血清可降低高糖刺激的ROS生成(P<0.01)(圖2B,C)。Western blotting結果顯示，與正常組相比，高糖組足細胞Nephrin蛋白表達顯著降低(P<0.05)，而保腎通絡方含藥血清可部分恢復足細胞Nephrin蛋白的表達水平(P<0.05)(圖2D)。

圖2 保腎通絡方含藥血清對足細胞骨架及氧化損傷的影響

2.3 保腎通絡方含藥血清對高糖誘導的足細胞線粒體自噬的影響

Western blotting結果顯示，與正常組相比，高糖組足細胞自噬相關蛋白ATG5、ATG7下調(P<0.01)，LC3Ⅱ/Ⅰ比值下降(P<0.05)，與高糖組相比，保腎通絡方組ATG5、ATG7蛋白表達上調(P<0.01，P<0.05)，LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高(P<0.05)(圖3A)。共聚焦顯微鏡顯示各組足細胞線粒體與LC3B免疫熒光共標情況，與正常組相比，高糖組線粒體MitoTracker和自噬蛋白LC3共標減少；而保腎通絡方含藥血清干預可使足細胞線粒體與LC3B共標增多(圖3B)。JC-1熒光探針進行足細胞染色，流式細胞術檢測各組足細胞線粒體膜電位水平，紅色熒光標記線粒體膜電位正常足細胞，綠色熒光標記為線粒體膜電位下降的足細胞，結果顯示，與正常組相比，高糖組紅色/綠色熒光標記的足細胞比值明顯降低(P<0.01)；與高糖組相比，保腎通絡方組紅色/綠色熒光標記的足細胞比值顯著升高(P<0.01)(圖3C,D)。以上結果表明，保腎通絡方含藥血清改善高糖培養下足細胞線粒體自噬障礙并減輕其線粒體損傷。

圖3 保腎通絡方含藥血清對足細胞線粒體自噬及線粒體膜電位的影響

3 討論

線粒體是細胞能量代謝的樞紐，而作為能量需求最為旺盛的器官之一，腎臟是除心臟外線粒體含量最為豐富的器官。線粒體功能障礙在DKD足細胞損傷中發揮了至關重要的作用[10]，研究[11]表明，糖尿病小鼠足細胞存在明顯線粒體損傷，長時間高糖刺激使足細胞線粒體呼吸鏈活性下降，線粒體DNA拷貝數明顯降低，足細胞數量減少。在本研究中筆者同樣發現高糖在導致足細胞損傷的同時，引起了足細胞線粒體功能障礙，主要表現為線粒體數目減少、線粒體膜電位受損。在線粒體中，主要依靠呼吸鏈復合物從還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADPH)/還原型黃素腺嘌呤二核苷酸(reduced flavin adenine dinucleotide, FADH2)接受電子進行傳遞，并由復合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ向膜間隙泵出H+從而形成線粒體膜電位，并由此與三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)合成酶相偶聯，最終在ATP合成酶作用下使二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)磷酸化生成ATP，因此，線粒體膜電位的形成是正常氧化磷酸化反應的重要前提，在這一過程中，線粒體呼吸鏈也會有少量的電子漏出，生成少量ROS，作為細胞正常代謝產物，在生理情況下會被細胞內的抗氧化物質及時清除。在糖尿病或高血糖狀態下，盡管代謝底物的增加產生更多的NADH/FADH2，但由于線粒體功能障礙導致電子不能正常傳遞而漏出，過量ROS不能被及時清除，從而造成氧化應激損傷[12]。高血糖導致線粒體生成過量ROS對其他細胞器造成氧化損傷的同時，也可對線粒體本身的脂類、蛋白質和核酸等造成損傷，導致線粒體功能障礙，從而進入氧化損傷的惡性循環狀態[13-14]。因此，除直接針對ROS進行抗氧化治療外，恢復線粒體功能，也可能是修復DKD足細胞損傷的重要靶點[15]。

線粒體自噬是通過自噬-溶酶體途徑，選擇性清除受損或不需要的線粒體，是細胞維持線粒體穩態極為重要的自我調節機制。當線粒體發生損傷時，可激活自噬清除異常線粒體以維持線粒體穩態，若病情進一步加重，受損線粒體過量積聚，線粒體自噬障礙導致受損的線粒體不能及時清除，最終造成足細胞受損[16]。LC3是自噬標記蛋白，參與自噬泡的生成[17]。當自噬激活時，LC3-Ⅰ脂質化形成LC3Ⅱ，LC3-Ⅱ與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺結合并定位在胞內自噬體膜上；與此同時，自噬相關蛋白12(autophagyrelated protein 12，ATG12)與ATG7作用后進而同ATG5發生共價結合，形成ATG5-ATG12復合物，該復合物再與ATG16、LC3Ⅱ結合形成更復雜的ATG5-ATG12-ATG16-LC3Ⅱ復合物，最終與自噬體膜相結合，包裹受損的線粒體，形成線粒體自噬體被溶酶體識別吞噬，啟動線粒體降解程序，完成線粒體自噬過程[18]。研究[19]表明，持續的高血糖狀態，會導致足細胞線粒體自噬能力明顯降低，且抑制線粒體自噬，會加重糖尿病小鼠足細胞損傷。在本研究中筆者也發現高糖刺激下自噬相關蛋白ATG5、ATG7、LC3 Ⅱ/Ⅰ表達下降，LC3B與線粒體共標減少。

繼承全國名老中醫、首都國醫名師張炳厚教授學術思想，本團隊認為“腎失封藏，腎絡閉阻”是DKD發病的核心病機，基于此，筆者以“益腎通絡”立法，在張勝容教授經驗方保腎系列方(保腎方、改良保腎方Ⅱ號)基礎上進一步優化，增強通絡作用，組方為保腎通絡方。方中以黃芪補氣益腎為君，熟地填補腎精為臣，二者合用益腎氣，補腎精，鬼箭羽、劉寄奴、丹參、菟絲子為佐，鬼箭羽、劉寄奴、丹參合用活血通經、祛瘀生新，菟絲子味甘澀精固腎，味辛又可發散通經，使補而不滯，水蛭蟲蟻入腎絡為使，咸苦并行、破血利水。全方通澀共施，以通入脈，以澀固精，合以辛潤通絡、蟲蟻通絡，使瘀血得除，絡脈得通而腎臟得補，精微得固，共奏“益腎澀精，活血通絡”之功。本研究顯示，保腎通絡方含藥血清可使高糖刺激的足細胞活力恢復、骨架結構改善，足細胞標志蛋白nephrin升高，ROS生成減少，說明保腎通絡方含藥血清能夠減輕高糖誘導的足細胞氧化損傷。進一步研究表明，保腎通絡方干預可恢復高糖誘導的足細胞線粒體膜電位，使自噬相關蛋白ATG5、ATG7表達及LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高且LC3B與線粒體共定位增加，提示中藥復方保腎通絡方能夠改善線粒體自噬障礙，減輕足細胞線粒體損傷。

綜上所述，足細胞氧化損傷與線粒體功能障礙、線粒體自噬受損密切相關，保腎通絡方可改善高糖培養下足細胞改善線粒體自噬障礙，清除受損線粒體，恢復線粒體功能，可能是保腎通絡方改善足細胞氧化損傷的作用機制，但其具體的作用通路和靶點仍需要進一步深入探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明王夢迪、趙文景：提出研究思路，設計研究方案；王夢迪、郭弋凡、龐彥余、劉羽飛：進行實驗，采集、分析數據和繪制圖表；王夢迪：論文撰寫；趙文景：總體把關、審定論文。