基于網絡藥理學及分子對接技術研究化濁解毒方治療慢性萎縮性胃炎活性成分作用機制研究※

楊 柳 李 澤 高云霄 賈雪梅 郭榆西 李博林 楊 倩△ 張 彤

(1.河北中醫學院研究生學院2019級碩士研究生，河北 石家莊 050091；2.河北中醫學院研究生學院2020級博士研究生，河北 石家莊 050091；3.河北中醫學院研究生學院2021級博士研究生，河北 石家莊 050091；4.河北省中醫院脾胃病三科,河北 石家莊 050011；5.河北省中西醫結合胃腸病研究重點實驗室，河北 石家莊 050011；6.河北醫科大學第四醫院呼吸科，河北 石家莊 050011)

慢性萎縮性胃炎是一種病因尚未完全明確，癥狀沒有特異性，胃鏡難以早期診斷，并有一定癌變風險的疾病，極大地威脅著人們的健康。由于發病機制不明確，現代醫學在治療上缺乏特效藥物，一般以根除幽門螺桿菌，對癥使用促胃腸動力、消化酶制劑、胃黏膜保護劑、抑酸藥物，或加用抗焦慮、抑郁藥物治療，效果不甚理想。中醫在治療慢性萎縮性胃炎方面有著能截斷病情發展，甚至逆轉萎縮的獨特優勢[1-2]。國醫大師李佃貴潛心中醫臨床50余年，提出了“濁毒理論”，并采用化濁解毒法，以化濁解毒方(藥物組成：茵陳、黃連、藿香、佩蘭、茯苓、砂仁、黃芩、半夏、厚樸、白花蛇舌草)[3-4]治療慢性萎縮性胃炎，取得了良好的療效[5-7]。在學習和傳承李佃貴大師化濁解毒方治療慢性萎縮性胃炎的過程中發現，多數研究是從傳統中醫學理論進行討論，缺乏現代藥理機制的研究，或對單個靶點進行研究，不符合中藥復方多中心、多靶點、多通路的特點。

網絡藥理學通過對現有藥物、疾病數據庫的檢索，靶點預測、富集分析，可以得到“藥物-成分-靶點-疾病”的相互作用網絡，系統闡釋中藥復方治療疾病的機制。本研究基于網絡藥理學及分子對接技術分析化濁解毒方治療慢性萎縮性胃炎的活性成分及關鍵靶點、物質基礎等，以為后續的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 數據庫及軟件 中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)，DrugBank數據庫(https://www.drugbank.com/)，UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)，CTD數據庫(http://ctdbase.org/)，TTD數據庫(http://db.idrblab.net/ttd/)，GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)，STRING數據庫(https://cn.string-db.org/)，RCSB PDB數據庫 (https://www1.rcsb.org/)，Venny2.1在線軟件作圖工具平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，DAVID數據庫 (https://david.ncifcrf.gov/)。Cytoscape 3.7.1軟件，PyMol，AutoDock，RStudio。

1.2 方法

1.2.1 化濁解毒方有效成分篩選 通過TCMSP以化濁解毒方中的10味中藥為關鍵詞進行檢索，以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL) ≥0.18為篩選標準，篩選獲得化濁解毒方中發揮作用的有效成分。

1.2.2 化濁解毒方有效成分作用靶點的收集 借助DrugBank數據庫獲取化濁解毒方有效成分的作用靶點，獲得有效成分潛在靶點信息。將靶點信息導入UniProt數據庫中，選取已被驗證的人類蛋白，將蛋白名統一規范為基因名稱。

1.2.3 慢性萎縮性胃炎靶點獲取 以“Chronic atrophic gastritis”為關鍵詞，在GeneCards、CTD和TTD數據庫查找與慢性萎縮性胃炎相關的靶點，去除重復靶點，獲得與慢性萎縮性胃炎有關的靶點。

1.2.4 潛在作用靶點的獲取 利用Venny 2.1在線軟件作圖工具平臺制作得到慢性萎縮性胃炎靶點與化濁解毒方有效成分作用靶點的交集靶點，視為潛在作用靶點。

1.2.5 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡構建及分析 將藥物、藥物的有效成分及潛在作用靶點導入Cytoscape 3.7.1軟件，繪制“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用網絡示意圖，使用Network Analyzer插件進行拓撲分析，網絡中每個節點的大小用度(Degree)值表示，Degree值的成分為主要有效成分。

1.2.6 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建及分析 將化濁解毒方治療慢性萎縮性胃炎的潛在作用靶點輸入到STRING數據庫中進行檢索，獲得可信度>0.7的PPI信息，將所得文件導入Cytoscape 3.7.1軟件可視化，得到PPI網絡圖，使用Network Analyzer插件進行拓撲分析，得到各靶點的Degree值，Degree值排名靠前的可能是核心靶點。并使用Cytoscape 3.7.1中MCODE插件功能對所得PPI網絡圖進行聚類分析，設置K-core值>4。

1.2.7 富集分析 將上述篩選得到的潛在作用靶點導入DAVID數據庫中，對潛在作用靶點進行基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，并運用RStudio軟件將數據可視化。

1.2.8 分子對接驗證 將篩選得到的主要有效成分與PPI分析得到的核心靶點進行分子對接驗證。檢索RCSB PDB數據庫中靶點蛋白，并保存為PDB格式，在TCMSP數據庫獲得有效成分的MOL2格式文件，使用PyMol對蛋白質進行刪除水分子、加氧去氫后，在AutoDock中與主要有效成分進行分子對接，計算得出它們之間的結合能，并運用PyMol將其結合方式可視化。

2 結果

2.1 化濁解毒方有效成分篩選結果 在TCMSP數據庫中共得到符合OB≥30%、DL≥0.18篩選標準的有效成分有84個，其中茵陳含有13個，黃連含有11個，藿香含有7個，佩蘭含有7個，茯苓含有6個，砂仁含有8個，黃芩含有32個，厚樸含有2個，半夏含有11個，白花蛇舌草含有5個。有些有效成分同時存在于2種或2種以上的藥物中，如槲皮素同時存在于茵陳、黃連、藿香、白花蛇舌草中，芫花素同時存在于茵陳和藿香中。結果見表1。

表1 化濁解毒方有效成分篩選結果

續表1

續表1

2.2 化濁解毒方有效成分作用靶點收集結果 通過DrugBank數據庫預測得到化濁解毒方84個有效成分的作用靶點，再將這些靶蛋白導入UniProt數據庫中，只取已得到驗證的人類蛋白，并將蛋白名統一轉化為基因名，最終得到105個靶點蛋白。

2.3 慢性萎縮性胃炎靶點獲取及潛在作用靶點獲取結果 從GeneCards、CTD、TTD 3個數據庫篩選出647個慢性萎縮性胃炎相關靶點，與化濁解毒方的105個作用靶點取交集，獲得40個交集靶點，分別為白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、原癌基因JUN、白細胞介素1β(IL-1β)、血管內皮生長因子 A(VEGFA)、腫瘤蛋白53(TP53)、CC趨化因子配體2(CCL2)等。見圖1。

圖1 藥物與疾病交集靶點韋恩圖

2.4 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡構建及分析結果 將化濁解毒方的藥物、藥物有效成分及40個潛在作用靶點輸入Cytoscape 3.7.1軟件，繪制“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖(見圖2)。使用Network Analyzer插件對網絡圖進行分析，在84個與潛在作用靶點相互作用的有效成分中，槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、β-谷甾醇、豆甾醇、異鼠李素及黃芩苷元的Degree值>10，推測這7個成分是化濁解毒方治療慢性萎縮性胃炎的主要有效成分。一種成分作用于多個靶點說明了中藥成分整體調節的特點，多種成分共同作用于同一個靶點的現象呈現了化濁解毒方重點治療的特點。前列腺素內過氧化物合酶1(PTGS1)和PTGS2均被多種化合物作用，許多研究發現，PTGS1和PTGS2在慢性萎縮性胃炎的發生發展中起著重要的作用[8]。證明本次靶點預測的方向與現有的研究方向相吻合。

圖2 藥物-成分-靶點-疾病網絡圖

2.5 PPI網絡構建及分析結果 將化濁解毒方與慢性萎縮性胃炎40個交集靶點上傳至STRING，選取可信度>0.7的蛋白構建PPI網絡，利用Cytoscape 3.7.1軟件對其進行可視化，排除1個沒有關聯關系的蛋白，PPI網絡圖(見圖3)中包含39個節點，189條邊，每個節點代表1個蛋白，蛋白與蛋白的作用通過線來呈現，線條越多的蛋白說明其參與的生物過程越多。超過平均Degree值9.45的靶點蛋白有16個，這16個靶點蛋白可能在慢性萎縮性胃炎的發生發展中起著重要的作用。將16個核心靶點按照Degree值大小排序(見表2)。同時使用Cytoscape 3.7.1的MCODE插件對PPI網絡進行聚類分析，其中有1組蛋白的K-core值為4，證明其中的蛋白有著更為緊密的聯系，它們可能執行著同一個生物過程(見圖4)。在其分析中發現其包含白細胞介素相關因子、抑癌基因、生長因子及細胞外基質溶解酶，與炎癥、癌癥的發生發展有關，說明化濁解毒方與“炎-癌轉化”密切相關。

圖3 PPI網絡圖

圖4 PPI網絡聚類分析圖

表2 Degree值排名靠前的靶點蛋白 例

2.6 GO功能富集分析結果 通過DAVID數據庫的GO 富集分析功能，獲得 101個生物學過程(BP)(P<0.01)，包括RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、一氧化氮生物合成過程的正向調節、基因表達的正調控、細胞對脂多糖的反應、基因表達負調控、脂多糖介導的信號通路、細胞增殖的正調控、對脂多糖的反應、轉錄的正調控、DNA模板化、轉錄DNA模板、信號轉導、凋亡過程的負調控等方面。17個細胞組分(CC) (P<0.05)，包括細胞外間隙、胞外區、細胞表面、細胞器膜、線粒體、小窩、內質網膜、膜筏、細胞質核周區、質膜外側等。19個分子功能(MF)(P<0.01)，包括酶結合、血紅素結合、類固醇結合、蛋白質同源二聚活動、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性、配體激活序列特異性DNA結合、單胺跨膜轉運蛋白活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、轉錄因子結合、蛋白酶結合、核心啟動子序列特異性DNA結合、受體信號蛋白酪氨酸激酶活性、類固醇激素受體活性、蛋白質酪氨酸激酶活性等方面。運用Rtools將分析結果按照P值由大到小排序，并將排名前15的條目可視化。見圖5。

圖5 GO功能富集分析柱狀圖

2.7 KEGG 通路富集分析 通過 DAVID數據庫進行KEGG通路富集分析，共獲得58條通路(P<0.01)，包括癌癥信號通路TNF信號通路、缺氧誘導因子-1(HIF-1)信號通路、膀胱癌、類風濕關節炎、T細胞受體信號通路、核苷酸結合寡聚化結構域(NOD)樣受體信號通路、核因子κB(NF-κB)信號通路、Toll樣受體信號通路、甲型流感、Ras信號通路、MAPK信號通路。按照P值由大到小排序，并將排名前30 的通路進行可視化處理(見圖6)。相關性較大的癌癥信號通路圖見圖7。

圖6 KEGG 通路富集分析氣泡圖

圖7 化濁解毒方對慢性萎縮性胃炎作用的癌癥通路靶基因的 KEGG 通路分析

2.8 分子對接結果 核心靶點IL-6、TNF、MAPK1、VEGFA、PTGS2在RCSB PDB 數據庫檢索獲取得到的晶體結構ID依次為：4CNI、2E7A、4IZ5、5F19、4DEQ，與主要有效成分進行分子對接。結果顯示，主要有效成分與核心靶點分子對接的結合能數值均為負值(見表3)，與TNF蛋白的結合能較高，其中異鼠李素和黃芩苷元通過氫鍵與TNF蛋白結合，見圖8。提示核心靶點與主要有效成分可以實現理論上的空間對接。

表3 分子對接結合能 kcal /mol

圖8 主要有效成分與核心靶點分子對接模式

3 討論

慢性萎縮性胃炎常伴有幽門螺桿菌感染，胃黏膜長期遭受損害易向腸上皮化生、假幽門腺化生、異型增生發展。有研究表明，有1/50的慢性萎縮性胃炎、1/39的腸上皮化生以及1/19的異型增生患者在20年內發展為胃癌[9]。故慢性萎縮性胃炎的治療策略應以抑制“炎-癌轉化”為主。目前，現代醫學多以對癥治療為主，尚未研發出針對“炎-癌轉化”靶點的特效藥物。國醫大師李佃貴認為，濁毒是慢性萎縮性胃炎發生發展的重要因素。現代人工作壓力大，生活節奏快，常有七情內傷損礙肝之疏泄，飲食不節中傷脾胃運化，導致肝木過旺克伐脾土，土虛則水侮。水谷入胃，消于脾陽，現脾陽虛衰，水谷滯于胃腸，中焦不暢，不能上通下達，日久則濕積不化而成濁，郁而不解而成熱，熱壅血瘀而成毒，終致濁毒內蘊。濁毒作為病理產物可損害胃黏膜，而濁毒致病具有起病緩慢、癥狀隱匿、病程較長、反復發作和纏綿難愈的特點，最終導致慢性萎縮性胃炎。故李佃貴治療慢性萎縮性胃炎多從截斷濁毒的生成入手，方以化濁解毒方。方中以藿香、佩蘭、砂仁芳香之品醒脾運脾，化濁辟穢；茵陳、黃連、黃芩、白花蛇舌草清熱化濁解毒；濕濁易化為痰濁，故加半夏以祛痰滌濁解毒；濁毒日久常伴腑氣不通，故加厚樸以通腑降濁；全方以攻逐為主，又加入茯苓以顧護脾胃之氣。

本研究發現，化濁解毒方的有效活性成分共84個，對應靶點105個，與慢性萎縮性胃炎相關的共同靶點40個。通過對“藥物-成分-靶點-疾病”網絡分析，得到Degree值>10的有效成分7個，它們可能是化濁解毒方治療慢性萎縮性胃炎的主要有效成分。其中槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、異鼠李素和黃芩苷元同屬黃酮類化合物，具有抗菌、抗炎、消除自由基、抗氧化及抑制腫瘤的作用[10-15]。研究還發現，漢黃芩素可以通過線粒體途徑誘導癌細胞的凋亡[16]。β-谷甾醇和豆甾醇同屬植物甾醇。β-谷甾醇可降低胃黏膜損傷，其作用機制可能與增強機體氧自由基(OFR)清除能力，提升血清一氧化氮含量，抑制TNF-α等炎癥因子的聚集和釋放有關[17]。豆甾醇在體外具有較強的抗氧化作用[18]。可以看出，化濁解毒方的主要有效成分主要通過抑制炎癥、抗氧化和促進病變細胞的凋亡起到治療慢性萎縮性胃炎的作用。

接下來，通過對潛在靶點作用的分析來討論化濁解毒方治療慢性萎縮性胃炎的作用機制。PPI網絡結果顯示，16個靶點為核心靶點。JUN作為一種原癌基因，其編碼的JUN蛋白可形成同源二聚體或與Fos蛋白結合形成異源二聚體，即為體內一種重要的轉錄因子激活物蛋白-1(AP-1)，AP-1可調控多種細胞因子、生長因子及炎癥介質的釋放，對多種轉錄因子如 NF-κB等有著調控作用，也是多條信號傳導通路中重要的效應分子，因而與炎癥、腫瘤等多種疾病有關[19]。通過網絡藥理學的方法分析得出，化濁解毒方的多種有效成分可以作用于JUN蛋白，可能起到了抑制炎癥發展，使具有癌變傾向的細胞凋亡的作用。VEGFA是血管內皮生長因子(VEGF)家族中6個亞型中的一員，是重要的促血管生長因子，VEGF蛋白作為配體作用于VEGF受體后可通過激活磷酯酰肌醇3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K/Akt)信號通路、MAPK信號通路的方式調控血管內皮的增殖和分化[20]。PTGS2編碼的環氧化物酶2(COX-2)可將花生四烯酸轉化為前列腺素E2(PGE2)，PGE2可以通過環磷酸腺苷/環磷酸腺苷依賴蛋白激酶依賴性蛋白(cAMP/PKA)信號傳導通路促進VEGF的表達[21]。又有研究表明，幽門螺桿菌感染可使癌前病變中PTGS2的基因表達上調，進而促進VEGF的表達[22]。慢性萎縮性胃炎多伴有幽門螺桿菌感染，因而化濁解毒方可以通過抑制PTGS2的表達，進而抑制VEGF的分泌，阻止血管內皮增殖、分化。癌細胞的增殖、轉移需要血管增生以提供營養，所以抑制血管增生是預防慢性萎縮性胃炎向胃癌轉變的重要方式。化濁解毒方通過作用于PTGS2阻斷了VEGF的表達，進而抑制了血管增生，減少了病變組織的營養供能，起到間接抑制癌變，發揮治療的作用。MMP-1是一種調節細胞外基質的間質膠原酶，與Ca2+、Zn2+等金屬離子結合后，可以溶解細胞外基質中的各種蛋白質，其表達在胃癌的發生發展中起著重要作用[23]。幽門螺桿菌的毒力因子可以通過誘導MAPK/細胞外信號調節激酶(ERK)的激活影響宿主上皮MMP-1的表達，從而破壞抑制腫瘤細胞侵襲的組織學屏障[24]。化濁解毒方可能作用于MMP1，使得MMP1基因表達下調，通過保護細胞外基質從而抑制胃癌細胞的轉移。

GO功能富集結果發現，參與靶點最多的BP為RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控。真核生物蛋白質編碼基因的轉錄是一個復雜的過程，需要多種蛋白的共同參與，其非常重要的一組即為轉錄因子與RNA聚合酶Ⅱ形成轉錄起始復合體[25]。RNA聚合酶Ⅱ由7～10個亞基形成，其中核心啟動子是RNA聚合酶與普通轉錄因子的結合位點，二者結合形成轉錄復合體后才能在正確的位置開始轉錄[26]。化濁解毒方可導致RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正向調控，發揮間接調節基因表達的功能。

KEGG通路富集結果發現，化濁解毒方通過多條通路來干預慢性萎縮性胃炎的進展。癌癥信號通路是多條與癌癥相關的通路的集合，通過對幾條通路的分析可以看出，化濁解毒方作用于癌癥信號通路中的MAPK信號通路和HIF-1信號通路。MAPK 是真核生物中一組具備高度保守結構的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被認為是細胞生理學和免疫反應中的關鍵細胞因子。其將從細胞質接收到的信號傳遞至細胞核，轉錄產生的蛋白質具備一系列的生物功能，包括細胞增殖、分化及凋亡、應激、炎癥、先天免疫等[27-28]。MAPK信號通路有3條主要的途徑，即MAPK經典通路、JUK/p38 MAPK通路、ERK5/MAPK信號通路。化濁解毒方主要作用于MAPK經典通路。各種細胞因子均可激活MAPK信號通路，激活Ras通路，進而促進MAPK的級聯激活[29]。通過研究KEGG通路發現，化濁解毒方的有效成分可作用于上游的ERK抑制MAPK信號通路，調整細胞周期，使病變或癌變的胃黏膜細胞凋亡，起到治療的作用。HIF-1是一種表達于細胞核的轉錄因子，是由HIF-1α和HIF-1β共同組成的異源二聚體，其中HIF-1α在有氧環境下被泛素-蛋白酶水解復合體降解，因而只有在缺氧環境下HIF-1α的降解被抑制時，HIF-1才可以表達活性，故又被稱為低氧誘導因子-1[30]。HIF-1信號通路主要通過腫瘤血管的生成、上皮間質轉化過程及抗腫瘤細胞凋亡參與腫瘤的生長、侵襲及轉移[31]。HIF-1可以促進VEGF的分泌，VEGF則可以刺激腫瘤血管生長，促進腫瘤細胞大量生長和增殖[32]。動物和細胞實驗證實，HIF-1α可以通過上調Slug基因的表達，促使腫瘤上皮間質轉化過程的發生[33]；HIF-1信號通路通過調節基因的轉錄從而抵抗腫瘤細胞凋亡，增加腫瘤的侵襲、轉移能力[34-35]。通過HIF-1信號通路圖可以看出，化濁解毒方的有效成分通過作用于VEGF從而抑制HIF-1信號通路的部分作用。

通過分子對接發現，化濁解毒方的主要有效成分與TNF的結合最為緊密。TNF可以通過直接殺傷作用、調節機體免疫，作用于血管內皮細胞的作用殺傷或抑制腫瘤細胞，也可以通過作用于IL-1、IL-8、IL-12、IL-18等炎癥因子調節炎性反應[36]。故化濁解毒方可能有良好的抑制“炎-癌轉化”的作用。

本研究旨在發揮網絡藥理學方法和分子對接的優勢，對現有數據庫進行歸納研究，初步預測化濁解毒方治療慢性萎縮性胃炎的有效成分、潛在靶點和作用機制。結果顯示，84個有效成分作用的105個靶點內有40個靶點與慢性萎縮性胃炎的發生發展顯著相關。化濁解毒方的有效成分通過干預這些靶點可以起到抗炎、抗氧化、正向調控細胞凋亡、負向調控血管內皮增生、保護細胞外基質等作用，進而發揮治療作用。本研究還發現，化濁解毒方可作用于30條信號通路，部分可能與慢性萎縮性胃炎的防治相關，為日后的實驗研究、靶向藥物的研發提供了理論基礎。但由于生化研究發展日新月異，網絡藥理學所使用的數據庫通常更新緩慢，且方法尚未完善；分子對接技術只能驗證其在空間結構的楔合度，所以得到的結論在可信度上存疑，有待于更新、更好的數據方法或動物實驗來進一步驗證。