干濕交替對南四湖底泥真菌群落影響研究

周冉張志斌張曉蕊孫杰張彥浩

(1.山東建筑大學 市政與環境工程學院，山東 濟南 250101；2.山東省環境保護科學研究設計院有限公司，山東 濟南 250012；3.山東省金膜再生水資源有限公司，山東 濟南 250100)

0 引言

微生物在湖泊底泥的有機物轉化、物質循環等方面發揮著重要的作用。微生物群落結構組成是衡量底泥理化性質、功能穩定性和健康狀況的重要“指示劑”。水分變化是影響底泥微生物種群結構和微生物對底泥養分利用的重要因素[1-2]。由于真菌類群在抗逆性和恢復力方面存在差異，頻繁的干濕交替會引發真菌種群結構的變化，進而可能會影響真菌種群功能變化[3]。劉奎等[4]研究了不同頻率、強度干濕交替和不同耕作方式影響下的東北農田黑土微生物的響應，發現干濕交替頻率對黑土中微生物的影響高于干濕交替強度。包麗君等[5]通過模擬實驗研究了水稻土中古菌種群對干濕交替的響應，表明微生物的重要類群并未因為反復干濕交替而發生較大改變，但古菌的生物量和相對豐度因干濕交替而發生明顯變化。目前，有關干濕交替對微生物群落的影響研究主要集中在土壤方面，而關于湖泊消落帶底泥干濕交替情況下真菌群落結構的變化研究還鮮有報道。

南四湖是南水北調東線最重要的湖泊之一，是東線調水工程的重要水利樞紐[6]，由于水位波動，其下級湖區大面積的消落帶底泥經歷頻繁的干濕交替。近年來，東線調水導致南四湖水質不時出現氮、磷營養鹽波動反彈，這可能與消落帶底泥污染釋放有關，底泥微生物對干濕交替過程中的營養鹽轉化起著重要的作用[7-9]。文章采用高通量測序技術[10]分析干濕交替過程中底泥真菌群落的結構變化以及真菌與底泥中理化性質的相關關系，以期為東線調水水質安全提供科技支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年8 月在南四湖消落帶區域(北緯34°27′～35°20′、東經116°34′～117°21′)采集0～10 cm表層底泥5 kg，剔除雜草和石塊，風干研磨后過4 mm的篩，一部分樣品分析底泥理化性質，其余部分用于淹沒-落干交替實驗。

1.2 實驗設計

實驗周期設置為120 d。實驗期采取淹沒(30 d)-落干(30 d)-淹沒(30 d)-落干(30 d)交替處理。實驗分別在淹沒、落干開始第3天和結束前第3天取樣，每個周期收集4組樣品，共收集8組樣品。每次采樣取50 g表層底泥于無菌托盤中平均分成兩份，一份保存于-4℃，用于測量底泥理化性質，另一份底泥立刻存于-80℃環境下進行高通量測序。

1.3 底泥理化性質測定

底泥樣品pH值和氧化還原電位(Oxidation Reduction Potential，ORP)采用電位法測定，總磷(Total Phosphorus，TP)采用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法測定，無機磷(Inorganic Phosphorus，IP)和有機磷(Organophosphorus，OP)采用標準化沉積物磷形態分析方法(Standard Measurements and Testing，SMT)進行分級提取，采用干燒法測定底泥中有機質的量，凱氏蒸餾法測定底泥中總氮(Total Nitrogen，TN)的量，總有機碳(Total Organic Carbon，TOC)采用總有機碳測定儀測定。

1.4 底泥真菌多樣性的測定

8個樣本中微生物群落總脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid，DNA)的提純根據E.Z.N.A.?soil DNA kit說明書進行，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量，采用NanoDrop2000測定8個樣本中目的基因條帶濃度和純度；采用ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS2R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)對內源轉錄間隔區(Internal Transcribed Spacer，ITS)區域進行聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)擴增[11]。每個樣品設置3次重復。PCR擴增后得到明亮清晰的基因條帶，以便于后續的實驗[12]。樣品純化定量后，利用因美納公司的Miseq PE300平臺進行測序[13]。

1.5 數據分析

數據分析采用R語言(version 3.3.1)軟件包；使用宏基因組分析軟件UPARSE(version 7.1)對序列進行分類操作單元(Operational Taxonomic Unit，OTU)聚類分析[12]；通過Unite數據庫，分析不同底泥樣品的真菌在屬水平上的種群結構組成；微生物群落結構與底泥理化性質的相關性采用冗余分析(Redundancy Analysis，RDA)相關性分析。

2 結果與分析

2.1 干濕交替過程中底泥真菌多樣性分析

利用OTU數量分別定量分析底泥兩次干濕交替過程中8個樣品的真菌量，結果見表1。在淹沒過程中，底泥真菌OTU數量逐漸減少；在落干過程中，真菌OTU數量顯著增加，且落干后期的真菌OTU數量較淹沒后期多。表明大部分真菌在好氧條件下繁殖能力更強，對干旱環境的抵御能力也更強。通過Alpha分析可以得出底泥中淹沒-落干期間真菌群落的豐富度。表1中覆蓋率均＞0.99，說明樣品中檢測到的真菌類群準確反映了樣品中真菌豐富度的真實情況。辛普森指數在淹沒期間高于落干期間，而香農指數與之相反，表明落干期間的真菌豐富度高于淹沒期間；Sobs指數和Chao指數在干濕交替過程中呈降低趨勢，表明干濕交替使得微生物豐富度逐漸減少。

表1 干濕交替過程中真菌OTU數量和多樣性指數表

2.2 干濕交替過程中底泥理化性質變化

干濕交替過程中表層底泥理化性質變化見表2。干濕交替過程中，底泥pH值淹沒后升高，落干后降低，底泥隨干濕交替的進行逐漸酸化。ORP淹沒后降低，落干后升高。底泥中TOC、TP、OP和IP的變化趨勢一致，均在干濕交替的影響下呈緩慢降低趨勢，TN的變化不顯著。

表2 干濕交替過程中底泥理化性質表

2.3 干濕交替過程中底泥真菌種群變化

底泥樣品中真菌種群結構組成差異如圖1所示。從結構可知，各個時間階段的真菌種群既有相似性也有差異性；從數量可知，經過兩次淹沒-落干的影響，樣品中的微生物真菌菌屬數量呈減少趨勢。通過高通量測序，8個樣品中共收集高質量DNA序列566156條，序列長度主要為200～300，平均長度為240。S1、S2、D1、D2、S3、S4、D3和D4中特有菌屬 數 目 分 別 為53(19.49%)、10(3.68%)、15(5.51%)、36(13.24%)、10(3.68%)、8(2.94%)、6(2.21%)和5(1.84%)種，共同包含的真菌菌屬共有15種。淹沒期間，4個樣品中共有5個共同菌屬，分別是擔子菌屬(Basidiomycota)、纖維孢子菌(Fibroporia)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、酵母菌屬(Eleutherascus)和粘束孢屬(Graphium)；落干期間4個樣品中只有1個共有菌屬，為節擔菌屬(Wellmia)。

圖1 各底泥樣品真菌群落組成差異圖

物種組成分析反映了8個樣品的群落結構。干濕交替過程中8個底泥樣品中的真菌分別屬于8個門、26個綱、215個屬，如圖2所示。在屬水平上，8個樣品之間底泥中的主要類群是翅孢殼屬(Emericellopsis)，占比0.9%～80.0%；支頂孢屬(Acremonium)，占比3%～26.7%。

圖2 各底泥樣品真菌結構圖

2.4 微生物群落結構與理化性質的冗余分析

通過冗余分析(通過樣點的散集形態，在象限的分布等來反映研究區的特點)對不同樣品的微生物群落和底泥理化性質的關系進行分析，如圖3所示。對于干濕交替過程中不同階段樣品中微生物群落，有機質(Organic Matter，OM)和ORP對微生物群落的結構影響最大，且兩者呈負相關；影響較大的理化性質為TP和pH，兩者成正相關；樣品中底泥理化性質中TP、pH、OP與OM、TN呈顯著負相關。

圖3 真菌群落屬水平與底泥理化性質的RDA分析圖

盡管底泥中真菌的豐度和數量遠遠少于細菌，但是真菌的呼吸作用卻明顯高于細菌，說明真菌的營養轉化能力在底泥中占有重要地位[14-15]。通過研究紅樹林消落帶沉積物中微生物在生態中的貢獻作用，發現腐生真菌是整個微生物網絡的關鍵組成部分，不僅與其他環境變量產生協同作用，甚至決定了整體微生物的群落結構組成，無論是在縱向還是橫向的分組中，真菌在環境變量和微生物種群結構變化都發揮了核心作用[16-17]。

在實驗中，干濕交替過程中不僅真菌群落結構發生顯著變化，而且真菌菌屬數量也成逐漸減少趨勢。這與劉奎等[4]研究的黑土中微生物群落結構變化與干濕交替相關性分析相似，高頻率的干濕交替減少了土壤中微生物的多樣性。真菌的群落結構分析表明，在不同時間階段，翅孢殼屬和支頂孢屬均為優勢菌屬且未被命名的菌屬占比逐漸增加。未被命名菌屬占比的增加表明在實驗過程中人為擾動較大。實驗初期，翅孢殼屬一直占有較高比例且底泥為堿性土壤，而底泥經歷兩次淹沒-落干后，pH值整體降低，翅孢殼屬占比減少，表明底泥pH值與翅孢殼屬之間相互影響[18-19]。這與IWAI等[20]研究的干濕交替情況下天然鹽類土壤中微生物群落結構和土壤理化性質變化的研究結論相似，干濕交替不僅改變了底泥理化性質，同時底泥中的真菌做出了相應的響應。

底泥理化性質是衡量底泥質量的重要指標。研究發現，干濕交替的影響下表層底泥pH值、含水量、ORP等發生變化，干濕交替降低了底泥中的氮、磷，這與郭晨輝等[21]研究的表層沉積物中磷釋放對水質產生的影響中，年內水量分配不均增大了區域內表層底泥中磷釋放風險的結論一致。ZHAO等[22]在研究瀾滄江水位波動引起的土壤退化結果顯示，水位波動降低了全氮的量。

湖泊底泥中真菌群落結構受不同理化性質的影響顯著不同[23]。實驗通過RDA冗余分析發現，干濕交替過程中真菌群落結構與有機質、氧化還原電位的相關性最顯著，磷類營養物質和pH值的相關性次之，而總氮的相關性最弱。不同環境理化性質都對微生物產生一定的影響，極大地擴展了微生物群落特征和底泥微生物群落豐度的發展趨勢，增加了微生物的多樣性[24]。

3 結論

根據上述研究，得到以下結論:

(1)干濕交替改變了底泥的理化性質和真菌的種群結構，真菌物種豐富度呈下降趨勢，淹沒、落干穩定期間，真菌微生物數量呈上升趨勢，穩定的環境有利于微生物的繁殖和生存，頻繁干濕交替對環境有破壞作用。

(2)8個樣本中微生物群落結構既有相似性，又有差異性，翅孢殼屬、支頂孢屬為樣本中優勢菌屬。干濕交替會改變底泥真菌的群落結構，干濕交替過程中，翅孢殼屬在真菌群落中占比逐漸降低，而未被命名真菌占比逐漸增加。

(3)干濕交替過程中，底泥中pH值、ORP變化顯著，OM、TP等物質呈降低趨勢，真菌群落結構受OM、ORP和pH的影響最大。