PGC-1α在槲皮素通過雌激素樣作用減輕FFA誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性中的機(jī)制

李麗紅李 欣李 碩楊艷萍郭建紅*

(1.山西醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室,肝病研究所,太原 030001;2.臨汾職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系,山西 臨汾 041000)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver diseases, NAFLD)是指在沒有大量飲酒或任何繼發(fā)性原因的情況下,肝出現(xiàn)過度的脂質(zhì)蓄積,TG是主要的脂質(zhì)儲(chǔ)存形式[1-2]。隨著超重、肥胖和糖尿病的流行,近來,國際專家小組將NAFLD重新命名為代謝相關(guān)脂肪性肝病(metabolic dysfunctionassociated fatty liver disease,MAFLD)[3]。重要的是,絕經(jīng)后女性NAFLD的患病率持續(xù)增加且肝纖維化程度和/或肝癌的進(jìn)展率更高[2]。我們在前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)小鼠去除卵巢后24周,可發(fā)生肝脂肪變性,且腹股溝皮下脂肪、腹膜后脂肪組織增多[4]。目前,臨床針對該疾病激素替代療法(hormone replacement therapy,HRT)是最直接、有效的方式,但使用HRT可能會(huì)增加冠狀動(dòng)脈、中風(fēng)等疾病風(fēng)險(xiǎn)[5],因此,有必要尋求新的藥物治療絕經(jīng)后女性NAFLD。

NAFLD的經(jīng)典發(fā)病機(jī)制是“二次打擊”學(xué)說,一次打擊是胰島素抵抗致肝細(xì)胞脂質(zhì)過度蓄積,二次打擊是過量的脂質(zhì)引發(fā)氧化應(yīng)激,進(jìn)一步導(dǎo)致肝細(xì)胞炎性反應(yīng),最終加速肝細(xì)胞壞死和纖維化[6]。隨著研究結(jié)果不斷豐富,目前“多重打擊”的發(fā)病機(jī)制更盛行。雖然其涉及的致病因素廣泛,但脂質(zhì)積累、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)仍是NAFLD主要的發(fā)病機(jī)制[7]。肝PGC-1α在NAFLD發(fā)病機(jī)制起著至關(guān)重要的作用[8],作為一種核轉(zhuǎn)錄共激活因子,它不僅可通過誘導(dǎo)肝PPARα的表達(dá)激活脂肪酸β氧化以減少肝細(xì)胞脂質(zhì)積累,而且可根據(jù)能量需求控制抗氧化酶基因的表達(dá)以消除氧化應(yīng)激。此外,PGC-1α可通過抑制NF-κB降低炎性反應(yīng)[9-11]。

先前研究表明,雌性小鼠在高脂飲食條件下可增加脂肪酸氧化基因PPARα的表達(dá)。同時(shí),雌性小鼠一方面可上調(diào)PGC-1α表達(dá)來增加抗氧化酶基因水平而減輕氧化應(yīng)激損傷,另一方面,還可降低肝炎性因子水平的表達(dá)[1,12]。槲皮素是一種低毒性、副作用少的天然植物化學(xué)物質(zhì),其在改善肝脂質(zhì)積累方面具有很強(qiáng)的潛力,甚至被稱為植物性的雌激素[13]。然而,槲皮素是否有類似雌激素的機(jī)制通路抵抗NAFLD發(fā)生,尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)以PGC-1α為突破點(diǎn),基于前期的在體實(shí)驗(yàn)[4],在體外肝細(xì)胞脂肪變性模型中,比較槲皮素和雌激素對脂肪酸氧化基因表達(dá)、ROS和TNF-α的影響,探討其中可能涉及的類似保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

人HepG2細(xì)胞株購自上海富衡生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

槲皮素(北京索萊寶科技有限公司,Q8010);雌二醇(MCE公司,HY-B0141);油酸鈉(S30245)和棕櫚酸鈉(S31807),均購自上海源葉生物有限公司;胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司,11011-8611);DMEM高糖培養(yǎng)基(SC102-01),購自賽文創(chuàng)新(北京)生物科技有限公司;CCK-8試劑盒(MCE公 司,HY-K0301-500T);油 紅O染 色 液(G1260)和蘇木素染色液(G1120),均購自北京索萊寶科技有限公司;TG測試盒(南京建成生物工程研究所,A110-1-1);BCA蛋白定量試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司,AR0146);ROS檢測試劑盒(大連美倫生物技術(shù)有限公司,MA0210);人TNF-α ELISA試劑盒(Bioswamp公司,HM10001);總RNA提取試劑(MF034-01)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(MF166-01)和Real-time PCR試劑盒(MF013-05),均購自北京聚合美生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫超速離心機(jī)和分光光度計(jì)(Eppendorf公司,德國);IX71熒光顯微鏡(OLYMPUS公司,日本);全波長酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司,SpectraMax190,美國);普通PCR儀(Bio-Rad公司,T100TMThermal Cycler,美國);熒 光 定 量PCR儀(STRATAGENE公 司,MX3005P,美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞采用DMEM高糖完全培養(yǎng)基(含1%青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清),于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞分組

細(xì)胞分為4組:對照組(Control)、模型組(FFA)、陽性藥雌激素對照組(E2)和槲皮素組(Que)。(1)Control組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng);(2)FFA組用1 mmol/L混合FFA溶液(油酸:棕櫚酸=2∶1)干預(yù)24 h;(3)以100 nmol/L雌激素預(yù)處理(E2/FFA)、聯(lián)合處理(FFA+E2)和后處理(FFA/E2)確定藥物最佳干預(yù)方式為后處理方式。E2/FFA:100 nmol/L E2預(yù)處理24 h+FFA干預(yù)24 h;FFA+E2∶100 nmol/L E2 和FFA同時(shí)處理24 h;FFA/E2:FFA干預(yù)24 h +100 nmol/L雌激素后處理24 h。(4)分別以100 nmol/L、1 μmol/L和10 μmol/L雌激素后處理(FFA/E2 100 nmol/L、FFA/E2 1 μmol/L和FFA/E2 10 μmol/L)以及(10、20和30)μmol/L槲皮素 后 處 理(FFA/Que10、FFA/Que20和FFA/Que30)確定藥物最佳干預(yù)濃度。按以上分組情況加入相應(yīng)的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后檢測各項(xiàng)指標(biāo)。在細(xì)胞處理(從造模到雌激素、槲皮素干預(yù)結(jié)束)48 h后,ROS再行DCFH-DA熒光孵育30 min后檢測,其它指標(biāo)直接按相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法檢測。

1.3.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

HepG2細(xì)胞以每升8×107個(gè)密度接種到96孔板,培養(yǎng)24 h,吸出培養(yǎng)基,加入不同濃度的E2溶液100 μL培養(yǎng)24 h,再加入CCK-8試劑10 μL培養(yǎng)1 h,酶標(biāo)儀于450 nm處測吸光度值。同法檢測不同濃度的Que溶液吸光度值。

1.3.4 油紅O染色觀察脂質(zhì)蓄積

細(xì)胞處理后,吸出培養(yǎng)基,PBS洗滌,加入4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗滌,加入油紅O工作液染色15 min,PBS洗滌,加入蘇木素染核1 min,PBS洗滌,顯微境下觀察拍照。

1.3.5 GPO-PAP法測定TG含量

細(xì)胞處理后,收集到1.5 mL離心管,每離心管加入200 μL裂解液,冰上靜置40 min。裂解液直接按照TG測試盒說明書操作測TG含量,余下裂解液離心后取上清,遵循BCA蛋白測定試劑盒說明書測蛋白濃度以校正TG含量。

1.3.6 DCFH-DA法檢測ROS水平

細(xì)胞處理后,PBS洗滌,加入10 μmol/L的DCFH-DA熒光探針孵育30 min,PBS洗滌,熒光顯微境下觀察拍照。

1.3.7 ELISA測定TNF-α含量

細(xì)胞處理后,細(xì)胞培養(yǎng)液收集到1.5 mL離心管,于4℃,1500 r/min離心10 min,取上清,遵循ELISA試劑盒說明書測TNF-α蛋白含量。

1.3.8 Real-time PCR檢測目的基因表達(dá)水平

細(xì)胞處理后,使用總RNA提取試劑提取細(xì)胞總RNA,分光光度計(jì)測RNA濃度,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照Real-time PCR試劑盒配制20 μL PCR反應(yīng)體系于熒光定量PCR儀擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系:Template DNA,2 μL;2X Realtime PCR Super mix,10 μL;Primer 1 (10 μmol/L),0.5 μL;Primer 2 (10 μmol/L),0.5 μL;DEPC水,7 μL。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃,30 s,1個(gè)循環(huán);PCR反應(yīng)95℃,15 s,60℃,15 s,72℃,30 s,40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。引物序列見表1。

1.3.9 圖像采集與制圖

采用OLYMPUS光學(xué)顯微照相系統(tǒng)采集油紅O染色和免疫熒光染色,使用GraphPad Prism 6.0軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),P＜0.05表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 確定藥物最佳干預(yù)方式與最佳干預(yù)濃度

CCK-8結(jié)果表明,0～10 μmol/L濃度的雌激素與0～30 μmol/L濃度的槲皮素均不會(huì)損害細(xì)胞活力,其中100 nmol/L雌激素細(xì)胞活力最高(P＜0.0001),見圖1,所以選擇100 nmol/L雌激素確定藥物最佳干預(yù)方式。與FFA組相比,藥物后處理方式紅色脂滴最少(圖2A),因此以后處理方式確定藥物最佳干預(yù)濃度。與FFA組相比,1 μmol/L和10 μmol/L雌激素后處理紅色脂滴均明顯減少(圖2B),結(jié)合1 μmol/L雌激素使細(xì)胞活力明顯提高(P＜0.001)。因而,采用1 μmol/L雌激素后處理用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與FFA組相比,30 μmol/L槲皮素后處理紅色脂滴最少(圖2C)。因而,采用30 μmol/L槲皮素后處理用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 槲皮素改善HepG2細(xì)胞脂肪變性

采用油紅O染色觀察肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積。與對照組相比,模型組紅色脂滴顯著增多;而與模型組相比,雌激素組和槲皮素組均使紅色脂滴明顯減少,見圖3。

圖3 油紅O染色HepG2細(xì)胞脂滴變化Figure 3 Lipid droplet changes in HepG2 cells by oil red O staining

2.3 槲皮素降低HepG2細(xì)胞TG含量

肝細(xì)胞TG含量可反映肝細(xì)胞脂質(zhì)積累的程度。與對照組相比,模型組肝細(xì)胞TG含量明顯增加(P＜0.001);而與模型組相比,雌激素組(P＜0.05)和槲皮素組(P＜0.05)使肝細(xì)胞TG含量均降低了;槲皮素組與雌激素組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖4。

注:與0 nmol/L雌激素組比, ***P＜0.001, ****P＜0.0001;與0 μmol/L槲皮素組比, *P＜0.05。圖1 不同濃度雌激素和槲皮素處理HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活力Note.Compared with the 0 nmol/L E2 group, ***P＜0.001, ****P＜0.0001.Compared with the 0 μmol/L Que group, *P＜0.05.Figure 1 Cell viability of HepG2 cells treated with different concentrations of estrogen and quercetin

2.4 槲皮素上調(diào)HepG2細(xì)胞PGC-1α表達(dá)

PGC-1α在調(diào)節(jié)脂肪酸β氧化功能、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)方面起著關(guān)鍵作用,采用Real-time PCR檢測PGC-1α mRNA表達(dá)。與對照組相比,模型組PGC-1α mRNA的表達(dá)下降(P＜0.05);而與模型組相比,雌激素組(P＜0.001)和槲皮素組(P＜0.01)使PGC-1α的表達(dá)均明顯上調(diào);槲皮素組與雌激素組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖5。

2.5 槲皮素激活HepG2細(xì)胞脂肪酸β氧化功能

PPARα是脂肪酸氧化代謝的主要調(diào)節(jié)因子,其下游靶基因CPT1α和ACOX1分別可反映線粒體和過氧化物酶體脂肪酸β氧化功能,采用Real-time PCR檢測PPARα、CPT1α和ACOX1 mRNA表達(dá)。與對照組相比,模型組PPARα、CPT1α和ACOX1 mRNA的表達(dá)均下降(P＜0.05);與模型組相比,雌激素組和槲皮素組均可使PPARα(P＜0.01)、CPT1α(P＜0.001)和ACOX1(P＜0.001)的表達(dá)顯著上調(diào);槲皮素組與雌激素組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖6。

注:A:不同處理的雌激素對HepG2細(xì)胞脂滴的影響;B:不同濃度的雌激素對HepG2細(xì)胞脂滴的影響;C:不同濃度的槲皮素對HepG2細(xì)胞脂滴的影響。圖2 雌激素和槲皮素對HepG2細(xì)胞脂滴的影響Note.A, Effect of different treatments of estrogen on lipid droplets in HepG2 cells.B, Effect of different concentrations of estrogen on lipid droplets in HepG2 cells.C, Effect of different concentrations of quercetin on lipid droplets in HepG2 cells.Figure 2 Effect of estrogen and quercetin on lipid droplets in HepG2 cells

2.6 槲皮素減輕HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激

細(xì)胞內(nèi)ROS水平可反映細(xì)胞的氧化應(yīng)激程度,DCFH-DA孵育后采用熒光顯微鏡觀察肝細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度變化。與對照組相比,模型組ROS綠色熒光信號(hào)明顯增強(qiáng);而與模型組相比,雌激素組和槲皮素組ROS綠色熒光信號(hào)均減弱,見圖7。

圖7 DCFH-DA染色HepG2細(xì)胞ROS水平Figure 7 ROS level of HepG2 cells by DCFH-DA staining

2.7 槲皮素抑制HepG2細(xì)胞炎性反應(yīng)

TNF-α是NAFLD發(fā)生發(fā)展中主要的炎性因子,采用ELISA檢測TNF-α蛋白含量。與對照組相比,模型組肝細(xì)胞TNF-α蛋白含量增多(P＜0.01);而與模型組相比,雌激素組(P＜0.001)和槲皮素組(P＜0.01)均使肝細(xì)胞TNF-α蛋白含量明顯減少;槲皮素組與雌激素組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖8。

3 討論

單純性肝脂肪變性可發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎,顯著增加了肝纖維化和肝硬化風(fēng)險(xiǎn),甚至發(fā)展為肝細(xì)胞癌[14]。PGC-1α的表達(dá)異常與NAFLD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究報(bào)道,患者肝PGC-1α的低表達(dá)可促進(jìn)NAFLD發(fā)生發(fā)展[15];PGC-1α基因敲除小鼠在短期饑餓后易發(fā)生肝脂肪變性[16]。本實(shí)驗(yàn)顯示,模型組PGC-1α的表達(dá)下降,出現(xiàn)脂質(zhì)積累和脂肪變性,表明PGC-1α低表達(dá)促使肝細(xì)胞脂肪變性的發(fā)生發(fā)展。槲皮素與陽性藥雌激素的作用類似,可上調(diào)PGC-1α的表達(dá),減輕肝細(xì)胞脂質(zhì)積累和脂肪變性,初步驗(yàn)證了槲皮素的雌激素樣肝保護(hù)作用。PGC-1α的表達(dá)上調(diào)不僅與槲皮素改善肝細(xì)胞脂肪變性有關(guān),并且與激活脂肪酸β氧化、減輕氧化應(yīng)激以及抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。

體內(nèi)脂肪酸主要通過脂肪酸β氧化清除,肝是脂肪酸β氧化最活躍的組織之一。如果脂肪酸β氧化障礙則使肝游離脂肪酸積聚和脂肪生成增加,促使NAFLD的形成。因此,激活脂肪酸β氧化功能是阻止NAFLD發(fā)生的關(guān)鍵。肝中大量表達(dá)PPARα,作為一種配體激活轉(zhuǎn)錄因子,能有效誘導(dǎo)線粒體和過氧化物酶體脂肪酸β氧化途徑的基因表達(dá)[17]。CPT1α是線粒體脂肪酸β氧化的關(guān)鍵酶,它是一個(gè)完整的線粒體外膜蛋白,可促進(jìn)脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化[18-19],但線粒體缺乏極長鏈脂肪酸(very long-chain fatty acids,VLCFAs)氧化所需的酶。ACOX1是VLCFAs在過氧化物酶體β氧化中的限速酶,VLCFAs被氧化成中鏈或長鏈脂肪酸,隨后被輸出到線粒體再進(jìn)一步氧化[18,20],因此,過氧化物酶體在脂肪酸β氧化中也起著重要作用。大鼠高脂飲食喂養(yǎng)后,脂肪酸β氧化基因CPT1α和ACOX1表達(dá)降低,誘導(dǎo)了肝脂質(zhì)積累[18]。此外,NASH患者肝中PPARα的表達(dá)降低[17,20]。本研究發(fā)現(xiàn),模型組PPARα、CPT1α和ACOX1的表達(dá)均下降,表明PPARα及下游靶基因CPT1α和ACOX1的低表達(dá)與肝脂質(zhì)積累有關(guān)。雌激素干預(yù)后,PPARα、CPT1α和ACOX1的表達(dá)均明顯上調(diào),激活了脂肪酸β氧化功能,從而改善肝細(xì)胞脂肪變性。欣喜的是,槲皮素干預(yù)后出現(xiàn)了雌激素類似的結(jié)果,再次驗(yàn)證了它的雌激素樣肝保護(hù)作用。

注:與對照組相比, ***P＜0.001;與模型組相比, #P＜0.05。圖4 HepG2細(xì)胞TG含量Note.Compared with the control group, ***P＜0.001.Compared with the FFA group, #P＜0.05.Figure 4 TG content of HepG2 cells

注:與對照組相比, *P＜0.05;與模型組相比, ##P＜0.01, ###P＜0.001。圖5 HepG2細(xì)胞中PGC-1α mRNA表達(dá)水平Note.Compared with the control group, *P＜0.05.Compared with the FFA group, ##P＜0.01, ###P＜0.001.Figure 5 PGC-1α mRNA expression level in HepG2 cells

注:與對照組相比, *P＜0.05;與模型組相比, ##P＜0.01, ###P＜0.001。圖6 HepG2細(xì)胞中脂肪酸β氧化基因相對表達(dá)水平Note.Compared with the control group, *P＜0.05.Compared with the FFA group, ##P＜0.01, ###P＜0.001.Figure 6 Relative expression levels of fatty acid β oxidation genes in HepG2 cells

氧化應(yīng)激在NAFLD發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的決定因素[21]。NAFLD的主要病理特征是大量游離脂肪酸堆積在肝細(xì)胞,線粒體脂肪酸β氧化增加呼吸鏈電子產(chǎn)生過量ROS,引發(fā)氧化應(yīng)激,致肝細(xì)胞損傷。線粒體過量ROS氧化細(xì)胞質(zhì)和線粒體不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,損傷線粒體功能,加重肝脂肪變性。同時(shí),線粒體過量ROS激活肝細(xì)胞或Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子,引起肝炎性反應(yīng)[22-23]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),模型組ROS和炎性因子TNF-α水平升高,這些變化與PGC-1α的表達(dá)下降同時(shí)發(fā)生,表明脂肪酸超載時(shí)PGC-1α的表達(dá)下降與氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)有關(guān)。與陽性藥雌激素結(jié)果一致,槲皮素抑制ROS和TNF-α生成,減輕了氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng),進(jìn)一步證明槲皮素發(fā)揮了雌激素樣肝保護(hù)作用。本研究還存在局限性,FFA培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞雖顯示出脂質(zhì)沉積、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)等方面特征,但HepG2細(xì)胞株與生理?xiàng)l件下肝細(xì)胞存在差異,還需謹(jǐn)慎考慮其是否能完全模擬NAFLD的所有特征。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)將會(huì)研究原代小鼠肝細(xì)胞以確認(rèn)更接近臨床的數(shù)據(jù)。鑒于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)不能完全模擬在體的環(huán)境因素,未來將會(huì)進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證槲皮素對絕經(jīng)后女性NAFLD的影響及作用機(jī)制。

綜上所述,在脂肪酸超載的條件下,PGC-1α表達(dá)下降在肝細(xì)胞脂質(zhì)積累方面起著重要作用,并且與脂肪酸β氧化功能障礙、氧化應(yīng)激以及炎性反應(yīng)密切相關(guān)。槲皮素可誘導(dǎo)PGC-1α表達(dá),激活脂肪酸β氧化、減輕氧化應(yīng)激以及抑制炎性反應(yīng),最終改善肝細(xì)胞脂肪變性。這些結(jié)果與雌激素的作用高度一致,提示槲皮素發(fā)揮了雌激素樣肝保護(hù)作用。