褪黑素調(diào)控NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)胃癌小鼠Th1/Th2免疫平衡及其機(jī)制

付 佳曹宇勃?jiǎng)?颯

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 第二腫瘤內(nèi)科,沈陽(yáng) 110000)

調(diào)查統(tǒng)計(jì)顯示,每年新發(fā)的胃癌病人和因胃癌死亡的病人接近80萬(wàn)～100萬(wàn)例,占全部的惡性腫瘤5.7%和8.2%,胃癌的發(fā)病率和死亡率分別排名第6和第2[1],嚴(yán)重威脅了人類(lèi)的生命健康,因此,急需更全面有效的治療手段。目前,研究顯示免疫抑制在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中起著重要的作用,Th1型免疫細(xì)胞可通過(guò)促進(jìn)干擾素-γ(interferon-γ,IFNγ)的表達(dá)提高機(jī)體的免疫反應(yīng),從而抑制胃癌的增殖和侵襲[2]。Th2細(xì)胞則發(fā)揮免疫抑制作用,并通過(guò)白介素-4(interleukin-4,IL-4)等的表達(dá)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、血管生成和進(jìn)展[3]。患者外周血中的Th1/Th2平衡向Th1偏移可提高機(jī)體免疫力促進(jìn)胃癌的清除[4]。褪黑激素是一種人體內(nèi)產(chǎn)生的吲哚胺,主要由松果體在應(yīng)對(duì)黑暗時(shí)產(chǎn)生,近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)褪黑素具有抗癌作用,細(xì)胞研究表明褪黑素會(huì)抑制胃癌細(xì)胞的增殖,但是其體內(nèi)抗胃癌能力尚不明確[5]。也有研究表明褪黑素具有提高機(jī)體免疫力的作用[6],但是其是否具有調(diào)節(jié)胃癌免疫抑制的作用仍不清楚。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路的激活會(huì)調(diào)控細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄功能,從而調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移、炎性反應(yīng)[7]。此外,NF-κB通路還參與T淋巴細(xì)胞向Th1/Th2的分化[8]。本研究旨在分析褪黑素調(diào)控NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)胃癌小鼠Th1/Th2免疫平衡及其機(jī)制

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)BALB/c小鼠共30只,6～8周齡,體重18～22 g,均由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(滬)2019-0020],飼養(yǎng)于錦州醫(yī)科大學(xué)[SYXK(遼)2019-0007]。本研究通過(guò)了錦州醫(yī)科大學(xué)的醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(2020PS001K),實(shí)驗(yàn)的全過(guò)程均遵循了3R的原則,給予人道主義關(guān)懷。

1.1.2 細(xì)胞

人胃癌細(xì)胞MKN45(ATCC?CCL-185,美國(guó))。

1.2 主要試劑與儀器

胃癌細(xì)胞載體microcarrier 6(ELYON BIO公司,美國(guó));DMEM培養(yǎng)基血清和抗體(Invitrogen公司,美國(guó));褪黑素(＞99%,YT1414,北京伊塔生物,中國(guó));Ki67(ab15580)、Bcl2(ab182858)免疫組化染色抗體(Abcam公司,美國(guó));ELISA試劑盒(碧云天公司,中國(guó));兔單克隆P65抗體(ab32536)、標(biāo)記HRP的山羊抗兔二抗以及兔單克隆GAPDH抗體(ab181602)(購(gòu)自美國(guó)的Abcam公司);RNeasy Mini相關(guān)的試劑盒、TRIzol(購(gòu)自德國(guó)的QIAGEN GmbH公司);SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(購(gòu)自中國(guó)的TaKaRa公司);PVDF膜(購(gòu)自美國(guó)的Millipore公司);BD Golgi StopTM試劑盒(BD-554715,上海創(chuàng)賽科技,中國(guó))。Nanodrop 2000的儀器和ECL的顯色試劑盒(購(gòu)自美國(guó)的Thermo Fisher公司);大鼠的Th1/Th2表型相關(guān)的抗體試劑以及流式細(xì)胞儀(購(gòu)自美國(guó)的Becton Dickinson公司);PCR儀(ABI7900,ABI公司,美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備

根據(jù)文獻(xiàn)[9]利用正常免疫小鼠構(gòu)建胃癌移植瘤。首先,將MKN45細(xì)胞放置于DMEM的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(內(nèi)含有鏈霉素0.1 mg/mL、10%的胎牛血清、青霉素100 U/mL)。細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境為溫度37℃、濕度95%以及CO2濃度5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。之后再向其中加入細(xì)胞載體microcarrier 6使之飽和,同時(shí)加入100 ng/mL的SDF-1α和VEGF并共同孵育3 h。然后將50 μg的(約含有細(xì)胞1×106個(gè)胃癌細(xì)胞)一次性注射到小鼠左側(cè)前肢皮下,在建模7 d后可以觸摸瘤體的生成即說(shuō)明成功建模。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組

20只建模成功的小鼠分為模型組、模型+褪黑素組,每組10只;10只健康小鼠為對(duì)照組。模型+褪黑素組小鼠在其腫瘤附近皮下多點(diǎn)注射10 mg/kg的褪黑素,每日1次,其余組注射等量的生理鹽水[10]。干預(yù)21 d(建模后28 d)后,通過(guò)頸椎脫臼處死小鼠,取出胃組織或者腫瘤組織,通過(guò)眼眶采集外周血。

1.3.3 腫瘤生長(zhǎng)情況

觀察腫瘤的每天具體生長(zhǎng)的情況,于第28天的時(shí)候統(tǒng)計(jì)腫瘤具體的重量和體積,采用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠的皮下腫瘤的具體大小情況,然后對(duì)體積進(jìn)行計(jì)算,公式則為:體積=[(長(zhǎng)度×寬度)/2]3×0.5236。

1.3.4 免疫組化染色檢測(cè)腫瘤組織中Ki67和Bcl2蛋白

通過(guò)檢測(cè)Ki67和Bcl2蛋白分析細(xì)胞增殖和凋亡情況。將組織在10%甲醛中固定,后包埋在石蠟中,切成4 μm厚的切片。然后把切片置于表面被0.1%濃度的聚L賴氨酸涂滿的載玻片上,脫蠟(二甲苯),用梯度濃度的乙醇(濃度由高到低為100%～70%)逐步的水合,之后再用PBS給予洗滌。通過(guò)pH=6.0的檸檬酸鈉緩沖液處理切片后給予熱誘導(dǎo)的修復(fù)。在室溫情況下,用30%濃度過(guò)氧化氫將玻片處理約10 min的時(shí)長(zhǎng)從而達(dá)到對(duì)內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶封閉的作用。用PBS仔細(xì)的沖洗之后,在室溫的情況下用牛血清的白蛋白(濃度為5%)給予10 min時(shí)長(zhǎng)的玻片封閉。之后,將它們與Ki67或者Bcl2抗體(經(jīng)過(guò)1∶100的比例稀釋)在4℃的情況下過(guò)夜孵育。用PBS仔細(xì)的洗滌后,將各個(gè)玻片和特定的被生物素化二抗放置于37℃的情況下給予60 min時(shí)長(zhǎng)的孵育。通過(guò)和蘇木精、3,3-二胺聯(lián)苯胺復(fù)染。于顯微鏡下仔細(xì)的觀察,利用半定量法進(jìn)行分析,染色的強(qiáng)度=染色評(píng)分(0～3分)×染色范圍(0～4分)。

1.3.5 ELISA檢測(cè)外周血IFN-γ和IL-4

小鼠外周血離心(4℃,12000 r/min,20 min)后利用移液槍將上層的全部血清慢慢的吸出之后,向里面加入相應(yīng)的抗體孵育2 h的時(shí)長(zhǎng)之后再往里面加適量的顯色劑,10 min時(shí)長(zhǎng)反應(yīng)結(jié)束后將其終止。然后對(duì)450 nm位置的吸光度給予檢測(cè),根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線算出IL-4、IFN-γ的濃度。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Th1、Th2細(xì)胞

利用不同梯度的離心把淋巴細(xì)胞層從外周血里面抽吸出來(lái),獲得了全部的淋巴細(xì)胞。分別加入2 μL的佛波酯/離子霉素混合物以及2 μL的布雷非德菌素A/莫能霉素混合物,在37℃下孵育6 h。然后加入3 μL的表面CD4熒光抗體,避光孵育30 min。接下來(lái),加入300 μL的固定/透化試劑后在4℃下孵育30 min。向樣本中加入IFN-γ或IL-4熒光抗體各2 μL,4℃下孵育30 min。樣本通過(guò)流式細(xì)胞儀分析,結(jié)果使用FlowJo(Tree Star Inc.,美國(guó))軟件實(shí)施分析。CD4+IFN-γ+作為T(mén)h1細(xì)胞,CD4+IL-4+則作為T(mén)h2細(xì)胞。

1.3.7 RT-qPCR檢測(cè)腫瘤組織中NF-κB mRNA

利用TRIzol試劑在1.3.4里面的淋巴細(xì)胞內(nèi)或者組織中將總的RNA提取處理,并采用Nanodrop 2000儀器實(shí)施定量。通過(guò)RNeasy Mini的相關(guān)試劑盒逆轉(zhuǎn)錄全部的mRNA,相應(yīng)的RT-qPCR反應(yīng)則采用 SYBR Premix Ex TaqTM實(shí)施:95℃情況下反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)2 min, 58℃情況下反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)20 s,然后在72℃情況下反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)20 s(此步驟則循環(huán)40次),以GAPDH作為此次研究的內(nèi)參,2-ΔΔCt法將相對(duì)的NF-κB表達(dá)水平計(jì)算出來(lái)。

1.3.8 Western blot檢測(cè)腫瘤組織中NF-κB蛋白

將1.3.4里面的淋巴細(xì)胞內(nèi)或者組織全部的裂解之后經(jīng)過(guò)離心(溫度設(shè)置為4℃,速度設(shè)置為12000 r/min,時(shí)長(zhǎng)設(shè)置5 min)將總蛋白全部的收集。通過(guò)SDS-PAGE(濃度為10%)將蛋白質(zhì)分離,并將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。加入濃度為5%的脫脂牛奶(溫度為室溫條件,時(shí)長(zhǎng)設(shè)置為2 h)封閉之后加入按照1∶500比例稀釋的NF-κB抗體于4℃情況下給予8 h時(shí)長(zhǎng)的孵育,洗滌結(jié)束后向其中加入二抗(按照1∶2000比例稀釋,溫度為室溫條件,時(shí)長(zhǎng)設(shè)置為1 h)。條帶則采用ECL給予可視化的處理,GAPDH為此次研究的內(nèi)參,分析相對(duì)的NF-κB蛋白的表達(dá)具體情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)則采用SPSS 19軟件分析,用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)代表計(jì)數(shù),用方差分析(ANOVA)評(píng)估,兩兩對(duì)比用SNK-q檢驗(yàn),以P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 褪黑素對(duì)胃癌小鼠模型腫瘤生長(zhǎng)的影響

與對(duì)照組比較,模型組、模型+褪黑素組的腫瘤體積和重量均顯著升高(P＜0.05);與模型組比較,模型+褪黑素組的腫瘤體積和重量均顯著降低(P＜0.05),見(jiàn)表1。

表1 褪黑素對(duì)胃癌小鼠模型腫瘤生長(zhǎng)的影響(±s,n=10)Table 1 Effect of melatonin on tumor growth in a nude mouse model of gastric cancer

表1 褪黑素對(duì)胃癌小鼠模型腫瘤生長(zhǎng)的影響(±s,n=10)Table 1 Effect of melatonin on tumor growth in a nude mouse model of gastric cancer

注:與對(duì)照組相比, *P＜0.05;與模型組相比, #P＜0.05。Note.Compared with control group, *P＜0.05.Compared with model group, #P＜0.05.

組別Groups體積(mm3)Volume重量(g)Mass對(duì)照組Control group 0.00±0.00 0.00±0.00模型組Model group 281.24±27.63* 0.31±0.04*模型+褪黑素組Model+melatonin group 173.55±24.72*# 0.20±0.03*#

2.2 褪黑素對(duì)胃癌小鼠模型胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與對(duì)照組比較,模型組、模型+褪黑素組的Ki67和Bcl2染色強(qiáng)度均顯著增強(qiáng)(P＜0.05);與模型組比較,模型+褪黑素組的Ki67和Bcl2染色強(qiáng)度均顯著減弱(P＜0.05),見(jiàn)圖1和表2。

表2 褪黑素對(duì)胃癌小鼠模型胃癌組織中Ki67、Bcl2染色強(qiáng)度的影響Table 2 Effect of melatonin on the intensity of Ki67, Bcl2 staining in gastric cancer tissues of mouse models of gastric cancer

2.3 褪黑素對(duì)胃癌小鼠模型Th1和Th2標(biāo)志細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比,模型組、模型+褪黑素組的IFN-γ水平顯著降低,IL-4水平顯著升高(P＜0.05);與模型組比,模型+褪黑素組的IFN-γ顯著升高,IL-4水平顯著降低(P＜0.05),見(jiàn)表3。

表3 褪黑素對(duì)胃癌小鼠模型IFN-γ 和IL-4水平的影響(xˉ±s,n=10)Table 3 Effect ofmelatonin on the expression of IFN-γ and IL-4 in a mouse model of gastric cancer

2.4 褪黑素對(duì)胃癌小鼠模型Th1/Th2水平的影響

與對(duì)照組相比,模型組、模型+褪黑素組的外周血中Th1比例和Th1/Th2比值均顯著降低(P＜0.05),Th2細(xì)胞比例顯著升高(P＜0.05);與模型組相比,模型+褪黑素組的外周血中Th1比例及Th1/Th2的比值升高明顯(P＜0.05),Th2細(xì)胞的比例降低明顯(P＜0.05),見(jiàn)圖2和表4。

表4 褪黑素對(duì)胃癌小鼠模型Th1/Th2水平的影響(±s,n=10)Table 4 Effect of melatonin on Th1/Th2 levels in mouse models of gastric cancer

表4 褪黑素對(duì)胃癌小鼠模型Th1/Th2水平的影響(±s,n=10)Table 4 Effect of melatonin on Th1/Th2 levels in mouse models of gastric cancer

注:與對(duì)照組相比, *P＜0.05;與模型組相比, #P＜0.05。Note.Compared with control group, *P＜0.05.Compared with model group, #P＜0.05.

組別 Groups Th1 Th2 Th1/Th2對(duì)照組Control group 8.68±0.75 6.37±0.65 1.36±0.12模型組Model group 6.33±0.71* 11.02±1.14* 0.57±0.07*模型+褪黑素組Model+melatonin group 7.62±0.86*# 7.85±0.84*# 0.97±0.11*#

圖2 褪黑素對(duì)胃癌小鼠模型Th1、Th2細(xì)胞水平的影響Figure 2 Effect of melatonin on the Th1, Th2 level of gastric cancer mouse model

注:A～C:蛋白Ki67的免疫組化染色;E～F:蛋白Bcl2的免疫組化染色。圖1 免疫組化染色檢測(cè)褪黑素對(duì)胃癌小鼠模型胃癌組織中蛋白Ki67和蛋白Bcl2表達(dá)水平的影響Note.A～C, Immunohistochemical staining of protein Ki67.E～F, Immunohistochemical staining of protein Bcl2.Figure 1 Effect of melatonin on the expression levels of protein Ki67 and protein Bcl2 in gastric cancer tissue of gastric cancer mouse model detected by immunohistochemical staining

2.5 褪黑素對(duì)胃癌小鼠模型腫瘤組織中NF-κB表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比,模型組、模型+褪黑素組的腫瘤組織中NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05);與模型組比,模型+褪黑素組NF-κB mRNA和蛋白水平顯著降低(P＜0.05),見(jiàn)圖3和表5。

表5 褪黑素對(duì)胃癌小鼠模型腫瘤組織中NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響(±s,n=10)Table 5 Effect of melatonin on the expression levels of NF-κB mRNA and protein in tumor tissues of gastric cancer mouse models

表5 褪黑素對(duì)胃癌小鼠模型腫瘤組織中NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響(±s,n=10)Table 5 Effect of melatonin on the expression levels of NF-κB mRNA and protein in tumor tissues of gastric cancer mouse models

注:與對(duì)照組相比, *P＜0.05;與模型組相比, #P＜0.05。Note.Compared with control group, *P＜0.05.Compared with model group, #P＜0.05.

組別 Groups NF-κB mRNA NF-κB蛋白NF-κB Protein對(duì)照組Control group 1.00±0.09 1.00±0.07模型組Model group 4.56±0.42* 3.92±0.36*模型+褪黑素組Model+melatonin group 2.17±0.20*# 1.86±0.17*#

圖3 褪黑素對(duì)胃癌小鼠模型腫瘤組織中NF-κB蛋白相對(duì)的表達(dá)水平的影響Figure 3 Effect of melatonin on the expression of NF-κB protein in the tumor tissue of a mouse model of gastric cancer

2.6 褪黑素對(duì)胃癌小鼠模型淋巴細(xì)胞中NF-κB表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比,模型組、模型+褪黑素組的淋巴細(xì)胞中NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05);與模型組比,模型+褪黑素組的NF-κB mRNA和蛋白水平顯著降低(P＜0.05),見(jiàn)圖4和表6。

表6 褪黑素對(duì)胃癌小鼠模型淋巴細(xì)胞中NF-κB表達(dá)水平的影響(xˉ±s,n=10)Table 6 Effect of melatonin on the expression of NF-κB in lymphocytes in mouse models of gastric cancer

圖4 褪黑素對(duì)胃癌小鼠模型淋巴細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)水平的影響Figure 4 Effect of melatonin on the expression of NF-κB protein in lymphocytes in mouse models of gastric cancer

3 討論

我國(guó)大部分胃癌患者在確診時(shí)已處于中晚期,這使患者的死亡率大大升高[11]。胃癌細(xì)胞的惡性增殖是導(dǎo)致治療失敗的主要原因[12],尋找有效的抑制胃癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡的藥物對(duì)于胃癌治療具有有重要的臨床意義。

褪黑素具有抗衰老、抗炎、促進(jìn)睡眠、以及血管舒張和抗纖維化的功能[13]。近年來(lái),褪黑素的抗癌作用被逐漸發(fā)現(xiàn),研究表明褪黑素可以抑制胰腺癌[14]、卵巢癌[15]、乳腺癌[16]等的進(jìn)展。最新研究發(fā)現(xiàn)褪黑素也具有抑制胃癌的功能,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明褪黑素可通過(guò)介導(dǎo)自噬抑制胃癌細(xì)胞的增殖[17]。Ki67是腫瘤細(xì)胞有絲分裂必不可少的蛋白,NF-κB蛋白的升高會(huì)促進(jìn)Ki67蛋白的表達(dá),從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖[18]。Bcl2是經(jīng)典的抗凋亡蛋白,Bcl2蛋白的過(guò)表達(dá)是導(dǎo)致胃癌發(fā)生和進(jìn)展的重要因素,并且Bcl2蛋白的表達(dá)也被NF-κB通路調(diào)控[19]。本研究利用胃癌細(xì)胞構(gòu)建了胃癌移植瘤小鼠模型,結(jié)果表明皮下注射褪黑素可顯著的抑制腫瘤組織的生長(zhǎng),并抑制腫瘤組織中增殖標(biāo)志蛋白Ki67和抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)。此外,胃癌組織中NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高,提示褪黑素則可在轉(zhuǎn)錄和翻譯的水平上抑制NF-κB的表達(dá)。Colombo等[20]的研究表明褪黑素可通過(guò)抑制NF-κB通路的水平抑制乳腺癌和胃癌的進(jìn)展。也有研究顯示褪黑素通過(guò)抑制NF-κB通路抑制COX-2的表達(dá),從而起到抗血液腫瘤的作用[21]。本次研究結(jié)果表明褪黑素可在mRNA和蛋白的水平上抑制NF-κB的表達(dá),從而Ki67和Bcl2蛋白的表達(dá),這會(huì)降低胃癌細(xì)胞的增殖能力并誘導(dǎo)其凋亡,從而抑制胃癌移植瘤模型的生長(zhǎng),起到抗胃癌作用。

為進(jìn)一步分析褪黑素抗胃癌的機(jī)制,本研究也基于Th/Th2從免疫的水平上分析褪黑素的胃癌機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)免疫抑制參與胃癌的發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,機(jī)體免疫能力的降低導(dǎo)致體內(nèi)生成的癌變細(xì)胞無(wú)法清除,從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[22]。此外,機(jī)體免疫力的降低,以及腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸特性,導(dǎo)致腫瘤組織不受限的生長(zhǎng)并發(fā)生轉(zhuǎn)移[23]。Th1/Th2細(xì)胞均是由CD4+T淋巴細(xì)胞分化而來(lái)的兩個(gè)亞群,其中Th1細(xì)胞介導(dǎo)免疫和炎性反應(yīng),Th1會(huì)通過(guò)分泌IFN-γ來(lái)促進(jìn)炎性反應(yīng),并解除免疫抑制,促進(jìn)腫瘤被免疫系統(tǒng)清除[24]。Th2細(xì)胞功能與Th1細(xì)胞相反,其可通過(guò)分泌IL-4、IL-10等誘導(dǎo)免疫抑制緩解炎性反應(yīng)[25]。在腫瘤中,Th2細(xì)胞分化比例升高,介導(dǎo)免疫抑制,Th2比例的升高也與胃癌患者不良預(yù)后有關(guān)[26]。此外,Th1/Th2細(xì)胞的分化和功能也受到NF-κB通路的調(diào)節(jié),研究表明H2S會(huì)通過(guò)介導(dǎo)NF-κB通路Th1/Th2 失衡,從而加劇脂多糖誘導(dǎo)的肺炎[27]。也有研究顯示細(xì)辛素對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎的改善與NF-κB通路的下調(diào)和 Th1/Th2平衡的回調(diào)有關(guān)[28]。為分析褪黑素對(duì)胃癌動(dòng)物模型Th1/Th2的影響,本研究利用免疫系統(tǒng)正常的小鼠構(gòu)建胃癌移植瘤模型,結(jié)果表明與健康小鼠比較,胃癌模型小鼠外周血中IFN-γ的水平降低,IL-4的水平升高,Th1細(xì)胞比例和Th1/Th2比值顯著降低,而Th2細(xì)胞比例升高,此外,淋巴細(xì)胞中NF-κB mRNA和蛋白的水平均顯著升高,這說(shuō)明胃癌移植瘤裸鼠模型中出現(xiàn)Th1/Th2的失衡,并且出現(xiàn)免疫抑制。而褪黑素不但提高了IFN-γ、Th1細(xì)胞比例和Th1/Th2水平,抑制了IL-4和Th2的水平,還在mRNA和蛋白的水平上顯著抑制了淋巴細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)。劉靜等[29]的研究表明體內(nèi)褪黑素的升高會(huì)促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞的活化,從而提高機(jī)體的免疫力。也有研究表明褪黑激素可通過(guò)平衡重癥肌無(wú)力中的外周血Th1/Th2比例發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[30]。本次研究結(jié)果表明胃癌會(huì)引起Th1的降低和Th2的升高,從而影響機(jī)體的免疫反應(yīng)誘發(fā)免疫抑制,而褪黑素則可通過(guò)的提高NF-κB的表達(dá)提高Th1細(xì)胞比例并抑制Th2細(xì)胞分化,從而使失衡的Th1/Th2向Th1偏移,并促進(jìn)IFN-γ的分泌抑制IL-4的分泌,解除免疫抑制,進(jìn)而起到抗胃癌的功能。

此外,本次研究也存在某些局限性。首先,本研究是定性額,只提示了褪黑素一定程度上具有抗胃癌和調(diào)節(jié)Th1/Th2的作用,但是其治療胃癌的劑量、安全性仍需要?jiǎng)游锖团R床研究。關(guān)于NF-κB在褪黑素抗胃癌中的必要性仍需要挽救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。并且褪黑素調(diào)控胃癌中NF-κB的表達(dá)的分子機(jī)制仍需要深入研究。

綜上所述,褪黑素可能通過(guò)調(diào)控NF-κB通路抑制胃癌移植瘤小鼠模型的腫瘤生長(zhǎng),并調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡。提示褪黑素可能是治療胃癌的有潛力的藥物。