銅對蚯蚓轉化牛糞過程抗生素抗性基因的影響

田雪力,李仲瀚,楊鳳霞,韓秉君,張克強 (農業農村部環境保護科研監測所,天津 300191)

近年來,養殖業的迅速發展產生大量的畜禽糞便,導致環境壓力驟增.2018年全國牛糞年產量1.82億 t[1].我國每年畜禽糞污綜合利用率不足 60%[2],如何做好畜禽糞污的無害化處理與資源化利用,提高糞污綜合利用率成為亟待解決的問題.另一方面,牛糞不僅含有豐富的有機質[3],而且含水量大、保水性強、透氣性好、發熱量低,是蚯蚓養殖較理想的基料.

為了促進動物生長、提高產量,重金屬常被用做添加劑被廣泛添加在畜禽飼料中[4],其中只有少部分被吸收利用,大部分重金屬以糞便的形式排出[5].與此同時,畜禽糞便中也檢出豐富抗生素抗性基因(ARGs).研究發現,磺胺類、四環素類抗性基因在牛場中被普遍檢出[6-7].谷艷茹等[8]除了有上述發現外,在糞便中檢出了blaOXA-1、blaTEM-1和blaampC等與人類健康密切相關的 β-內酰胺類 ARGs.研究還發現糞便中ARGs的豐度與其含有的抗生素以及砷、銅等重金屬濃度顯著相關,且砷、銅等重金屬和抗生素的復合污染可以增加環境中 ARGs的豐度[9].另外,在重金屬污染地區發現微生物不僅對重金屬產生抗性,并且還能對多種抗生素產生抗藥性,且ARGs水平隨重金屬污染水平增加而增加[10].Stepanauskas等[11]在微宇宙實驗中發現水中ARGs及耐藥菌的檢出頻率隨重金屬暴露濃度的升高而升高.目前國內外缺少重金屬對蚯蚓轉化牛糞過程中ARGs影響的研究.在重金屬存在的情況下蚯蚓轉化引起ARGs的變化尚不完全明確.

本研究選取牛糞中殘留量最高的重金屬Cu為研究對象,利用實時熒光定量PCR技術,追蹤考察不同濃度Cu脅迫下蚯蚓轉化牛糞過程中ARGs的消長變化.通過測定不同Cu濃度處理組及其不同轉化時段樣品中 ARGs的豐度,并分析蚯蚓轉化牛糞過程中不同環境因子(TN、TP、含水率、TOC、pH值等)的變化規律及其對 ARGs的貢獻,旨在揭示蚯蚓轉化牛糞過程中重金屬影響 ARGs的潛在機制,為采取適合措施以減輕蚯蚓養殖場環境中ARGs的傳播提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試蚯蚓為赤子愛勝蚓(Eisenia fetida),為本實驗室飼養,單體重 0.50g左右.試驗前將蚯蚓在牛糞環境下馴化30d,實驗時挑選健康、帶有明顯生殖環帶的蚯蚓,用無菌水清洗表面后放置于裝有濕潤濾紙的干凈燒杯中,暗環境下保持 24h,使其排出體內糞便.

供試牛糞采自本實驗站自養泌乳奶牛,經混勻后自然堆肥15d.其基本理化性質為:pH值為7.8、含水率為81.3%、總氮為2.24%、總磷為1.42%.

1.2 試驗設計

試驗體系以牛糞為主料,添加少量養殖基質供蚯蚓生存,共設5個處理,每個處理3個重復.其中,CK為無蚯蚓對照組;CF(未添加 Cu+蚯蚓)、T1(低濃度100mg/kg Cu脅迫+蚯蚓)、T2(中濃度500mg/kg Cu脅迫+蚯蚓)、T3(高濃度1000mg/kg Cu脅迫+蚯蚓)為處理組.重金屬選取奶牛養殖過程中飼料常用添加劑且生物毒性較強的Cu進行試驗,根據牛糞中重金屬Cu的實際殘留量范圍(5～1257mg/kg)設置3個濃度梯度.

按照分組要求將牛糞用重金屬Cu處理,具體方法:用無菌蒸餾水將牛糞調整至含水量 70%左右,向不同試驗處理組加入不同量的重金屬 CuSO4,使得兩者在牛糞基質中添加濃度梯度分別為100,500,1000mg/kg,混勻后分別裝入塑料養殖盒(盒底直徑11cm,盒口直徑 15cm,盒高 7.5cm)中,并做好標記,每盒裝200g;而空白組即為未添加重金屬Cu作為對照;然后取30 條蚯蚓均勻地放置在每盒的牛糞基料上,盒子四周用鋁箔紙做避光處理,并用 3 層紗布封蓋,保證透氣并防止蚯蚓逃跑,同時為保持水分和濕度,通過計重方式每隔2d噴灑一次無菌水.培養過程中,于第1,7,14,28,35,42,49d進行破壞性取樣,收集蚯蚓與培養基質.

1.3 分析指標與測定方法

1.3.1 理化指標 樣品測定理化指標和方法詳見表1[12].

表1 樣品測定指標與方法Table 1 Indicators and methods of sample determination

1.3.2 DNA提取 采用Fast DNA SPIN Kit for soil試劑盒(MP Biomedicals, LLC, Santa Ana, CA, 美國)按操作手冊對0.5g糞便進行DNA提取,采用超微量紫外可見光分光光度計 Nano Drop 2000 (Thermo Fisher, USA) 和瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA質量.提取與檢測完成后,將 DNA 樣品放置于-20℃冰箱中暫存.

1.3.3 實時熒光定量 PCR 本研究對 8類 24個ARGs進行 qPCR檢測,即磺胺類抗生素抗性基因sul-ARGs (sul1、sul2)、四環素類抗生素抗性基因tet-ARGs (tetO、tetQ、tetW、tetL、tetX)、喹諾酮類抗生素抗性基因qnr-ARGs (qnrS、qnrB、oqxB)、大環內酯類抗生素抗性基因 erm-ARGs (ermB、ermC),鏈霉素類抗生素抗性基因 str-ARGs (strA、strB、aadA)、β-內酰胺類抗生素抗性基因bla-ARGs(blaGES-1、blaOXA-1、blaTEM-1、blaampC)、多粘菌素抗性基因(mcr-1)、氯霉素抗性基因(cfr、fexA).使用儀器7500實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,美國)進行實時qPCR分析.根據提取DNA樣品的濃度與標準曲線的定量范圍,研究中將 DNA樣品用ddH2O進行10倍稀釋.qPCR反應體系為20.0μL,包括 10.0μL TB Green Premix Ex Taq(Tli RNase H Plus, Takara)、上下游引物各 0.4μL、0.4μL ROX Reference Dye II、6.8μL ddH2O 和 2.0μL DNA 模板.每個 DNA模板設置 3個平行,無菌水為陰性對照,qPCR反應程序和標準曲線的制作參照文獻[13].

1.4 數據分析

采用SPSS V22.0對數據進行ANOVA方差分析,以 P＜0.05作為差異顯著水平.采用 R 軟件的pheatmap包制作熱圖,Origin 95繪制了柱狀圖和折線圖,RDA分析采用CANOCO 5軟件.數據的相對豐度(ARGs copies/16S rRNA gene copies)、平均值和標準差的計算均使用Microsoft Excel 2007.

2 結果與討論

2.1 蚯蚓轉化牛糞過程中 ARGs的賦存多樣性特征

在考察的24種ARGs亞型中,僅qnrS未檢出,其余 23種亞型在蚯蚓轉化牛糞的不同時間階段均有檢出,其檢出頻率范圍為2.90%～100%.總體來看,磺胺類(sul-ARGs)、四環素類(tet-ARGs)與鏈霉素類抗性基因(str-ARGs)存在較為普遍且污染水平較高,這可能與畜禽養殖過程中因該類抗生素價格低廉且對多種細菌具有較好抑制效果而使用較為普遍有關,從而導致了轉化底物牛糞中相應的 ARGs賦存較為豐富[14].值得注意的是,在蚯蚓轉化過程中,與人類健康密切相關的高風險 β-內酰胺類 ARGs(blaNDM-1、blaGES-1、blaOXA-1、blaTEM-1、blaampC)在基質中的檢出率也較高(40.00%～100%);而喹諾酮類抗性基因(qnrS、qnrB、oqxB)的檢出率最低,平均為39.00%.上述結果表明,蚯蚓轉化牛糞過程中, ARGs存在普遍,具有種類多樣、多種耐藥機制并存的污染特點;且大部分基因可跨越這個階段,依然以一定濃度而殘留在轉化產物蚓糞中,增加了蚓糞的后續利用風險[15-16].

如圖1所示,在CK中,除了qnr-ARGs及mcr-1,其他類ARGs均普遍存在.其中, tetW、tetX、sul1、sul2、strA、strB和aadA賦存水平相對較高,數量級高達 10-4～10-1copies/16S copies;而喹諾酮類 ARGs中qnrS和oqxB的相對豐度僅為10-8～10-7copies/16S copies.在不同濃度 Cu處理組的處理全過程,相對豐度較高的亞型為sul1、sul2,這可能是因為重金屬Cu驅動了含有sul1和sul2的細菌宿主的選擇[17].在本研究中檢測的關于tet-ARGs中,豐度最高的基因亞型為酶修飾基因tetX,且隨著Cu濃度升高tetX豐度也升高,原因可能是添加的重金屬濃度不同導致蚯蚓腸道菌群存在差異[18].值得注意的是,與未添加蚯蚓的CK處理組相比,添加蚯蚓的處理組CF、T1、T2和T3中ARGs的賦存多樣性有所降低,此結果表明蚯蚓對部分 ARGs具有較好去除效果.此外,從相對豐度來看,添加蚯蚓CF與未添加蚯蚓組CK相比,添加蚯蚓有助于鏈霉素類抗性基因 strB的去除.然而,蚯蚓轉化后,轉化產物蚓糞中依然存在多種ARGs.Ding等[19]對長期施用雞糞及污泥的土壤蚯蚓腸道中的 ARGs進行研究中也發現,飼喂雞糞和污泥后顯著增加了蚯蚓腸道中ARGs的豐度及多樣性,蚯蚓作為動物轉化的關鍵,腸道 ARGs豐度和多樣性的增加說明蚯蚓腸道是 ARGs的儲存庫,這可能也是蚯蚓轉化污泥及畜禽糞便難以完全去除ARGs的原因之一.

圖1 蚯蚓轉化過程中不同時間階段ARGs豐度的變化Fig.1 Changes in the abundance of ARGs at different time stages during earthworm conversion

由圖2可見,不同Cu濃度處理下ARGs總豐度呈現出 CF＜CK＜T3＜T1＜T2 的趨勢,整體相對豐度水平在0.43～2.78的范圍內.與CK處理相比,加入蚯蚓后(CF組)ARGs的總豐度從0.53降低至0.43.但加入低濃度和中濃度的Cu可顯著提高樣品中ARGs的總豐度水平(P＜0.05),且中濃度處理組T2中的ARGs豐度水平增加最高,總豐度可達 2.78,其次為低濃度處理組T1處理,ARGs總豐度亦達1.43.在一定范圍內,隨著Cu濃度的增加,ARGs總豐度也增加,此結果進一步驗證了重金屬可以通過協同選擇和交叉選擇增加ARGs的豐度[12].Cu濃度最高的T3處理組中ARGs的總豐度低于T1和T2組,這主要是因為低、中濃度的Cu對ARGs篩選與傳播的促進作用致使T1和T2組ARGs豐度增加[20],而高濃度Cu對微生物活性的抑制作用又限制了T3處理組中ARGs的增殖[21].從ARGs的類別來看,不同Cu濃度處理下樣品中的優勢基因主要為sul1、sul2和tetX,各處理中ARGs水平最高的亞型均為sul2 (0.02～1.96),占總豐度的 35.87%～83.55%.此外,雖然與人類健康密切相關的高風險bla-ARGs在總豐度中占比較低,但其中的 blaOXA-1、blaTEM-1和 blaampC亞型檢出率極高,分布廣泛,也應引起重視.

圖2 不同Cu濃度處理下基質中ARGs的總相對豐度Fig.2 Total relative abundance of ARGs in the substrates with different levels of Cu

2.2 蚯蚓轉化牛糞過程中不同作用類型 ARGs的消長變化規律

圖3 不同種類ARGs在不同時間階段的變化Fig.3 Changes of different types of ARGs at different time stages

在所檢測的8類ARGs中,sul-ARGs的豐度最高,bla-ARGs的豐度最低.同類ARGs在不同處理組中的消長趨勢存在差異,如 sul-ARGs,在對照組CK的相對豐度在第 7d達到最大值,然后降低并趨于穩定;在CF和T3處理組sul-ARGs的相對豐度在蚯蚓轉化過程中的變化趨勢與CK對照組基本一致;但 T1和 T2處理組中sul-ARGs的相對豐度在第14d達到最大值,峰值出現時間后移,且 T2在第 7d和14d sul-ARGs的相對豐度顯著(P＜0.05)高于CK和CF的峰值.對于tet-ARGs,在CK、T1和T3處理組均在第14d達到峰值,隨后趨于平穩.而T2組峰值則出現在第7d,第14d出現豐度下降,隨后趨于平穩.與sul-ARGs和tet-ARGs不同,str-ARGs 在CK、T1、T2和T3的最大值均出現在第14d,且在所選定的8類抗性基因中,蚯蚓轉化對str-ARGs的去除效果最好,且中濃度Cu處理組T2對str-ARGs去除效果最佳.

低濃度和高濃度的Cu(T1、T3)處理提高了蚯蚓轉化不同階段中大部分的 ARGs的豐度,如 tet-ARGs、erm-ARGs和str-ARGs.這表明糞污中重金屬Cu的殘留會導致蚯蚓轉化過程中多類ARGs的富集.錢勛[22]研究了畜禽糞便中殘留的重金屬Cu和Zn對好氧堆肥過程中 ARGs的影響,發現模擬的 2個 Cu濃度(200和 500mg/L)均增加了包括四環素類、大環內酯類和喹諾酮類中5種ARGs亞型的豐度.Li等[23]發現 2000mg/LCu顯著提高了堆肥過程中微生物對泰勒菌素和萬古霉素的抗性.而在中濃度 Cu處理組 T2中,sul-ARGs、tet-ARGs和 str-ARGs的豐度在蚯蚓轉化后均較初始值降低,此結果可能是因為該濃度的Cu通過促進蚯蚓的生長,提高了蚯蚓的處理效率,進而降低了牛糞中的 ARGs,此種猜測有待進一步證實.

2.3 不同Cu濃度脅迫下蚯蚓轉化牛糞前后ARGs的差異分析

由圖4可見,經過 49d的蚯蚓轉化后,產物中大多數ARGs有降低現象,而部分亞型如sul2、strA和blaGES-1的含量水平經蚯蚓轉化后卻在所有處理中豐度均出現升高.但亞型blaampC和qnrB在不同處理中變化不同: blaampC中CF處理升高,其余處理降低.說明加入蚯蚓導致其升高,但是加入重金屬Cu后對其有去除作用,且差異顯著(P＜0.05).基因qnrB在T1和T2處理中升高,其余處理中降低.tetX的豐度在對照組CF中未顯著降低,可能是因為該基因主要存在于革蘭氏陰性菌中[22],較難去除,但由于試驗組中高濃度 Cu 對革蘭氏陰性菌具有抑制作用[24],從而導致tetX的豐度在添加Cu濃度最高的處理組T3中的增長得到了一定程度的控制.

圖4 蚯蚓轉化前后ARGs的變化Fig.4 ARGs of earthworms before and after conversion

tetL為外排泵基因,存在于細菌細胞膜上,可外排抗生素等毒性物質,添加重金屬 Cu對tetL的去除在CK、CF、T1和T3組中有抑制作用.這是因為細菌暴露于Cu存在的環境中時,生物膜將會被誘導生長,同時導致存在于細菌細胞膜上的外排泵基因增多[25].蚯蚓轉化前牛糞中未檢出 oqxB基因,但蚯蚓轉化后出現oqxB基因,這可能是由于蚯蚓腸道中存在oqxB基因,后經過腹轉化進入蚓糞樣品.后續研究可以針對蚯蚓腸道進行研究.

2.4 蚯蚓轉化過程中 ARGs的變化與環境因子的關系

為了探討造成蚯蚓轉化牛糞過程中ARGs變化的潛在因素,本研究通過冗余分析確定 ARGs與重金屬及環境因子之間的關系.研究發現,對樣品中ARGs差異影響最大的因素是pH值含量,占貢獻率的55.10%.如圖5所示,含水率與基因tetM、tetW、tetL、tetQ、strA、aadA、strB、blaNDM-1、cfr、fexA、blaTEM-1、sul2、mcr-1和 blaGES-1成正相關,含水率升高,上述基因豐度增加,故在實際養殖過程中可以在保證蚯蚓存活的條件下降低養殖基質中的含水率以抑制 ARGs豐度增加.Cu與抗生素抗性基因blaOXA-1、blaampC、blaNDM-1、blaOXA-1、oqxB、qnrB、tetO、tetW、tetX、tetL、tetM、ermB、ermC和fexA呈正相關(P＜0.05).此外,大部分ARGs指向Cu處理所在的第三象限,說明Cu的加入使得ARGs的相對豐度增加.Cu是影響ARGs豐度的重要因素,前人研究也得到了類似的結果[26].已有研究也表明重金屬可以通過協同選擇和交叉選擇增加ARGs的豐度[10].重金屬在環境中很難降解,可以對環境中的 ARGs產生持續性的選擇壓力.亦有研究報道土壤中攜帶ARGs的細菌可以通過植物組織氣孔或機械損傷轉移并存在于植物根內,隨著植物的生長 ARGs可以到達植物葉片[27-28],進而進入生物鏈[29].蚓糞含有多種重金屬和ARGs[1],如果直接施用于農田,可能存在ARGs沿食物鏈擴散的風險.

圖5 蚯蚓轉化過程中ARGs的消長與環境因子之間的關系Fig.5 Relationship between changes in ARGs and physicochemical properties during earthworm conversion

牛糞樣品中的TN和TP水平也是造成樣品間差異的部分原因,這表明動物的飼料結構可能會影響牛糞樣品的 ARGs[30].pH值變化可能會抑制微生物的自我復制過程,從而對 ARGs的傳播產生影響,這與前人研究相一致[31].綜上,蚯蚓轉化牛糞雖然在一定程度上降低了牛糞中 ARGs的多樣性和豐度,但在處理后的蚓糞中仍有ARGs,其中包括高風險的bla-ARGs,它們在蚯蚓養殖環境、農田環境甚至食物鏈的殘留和流動不容忽視.

3 結論

3.1 ARGs遍布蚯蚓轉化全過程,且污染最為嚴重的是 sul-ARGs(sul1 和 sul2,10-3～100),其次是 tet-ARGs(tetX、tetW和tetO,10-4～100)和str-ARGs(strA、strB 和 aadA,10-1～10-3),令人擔心的是,一些與人類健康密切相關的高風險ARGs (如blaampC、blaOXA-1和blaTEM-1)在蚯蚓轉化過程中亦普遍存在.

3.2 蚯蚓轉化可加速牛糞中 ARGs的削減,與未加入蚯蚓的 CK處理相比,加入蚯蚓的 CF處理中ARGs的平均總豐度由 5.28×10-1copies/16S copies削減至 4.33×10-1copies/16S copies,且發現蚯蚓轉化對str-ARGs的去除效果較佳,中濃度Cu處理組的效果最優.

3.3 不同Cu濃度脅迫下,不同類型ARGs在蚯蚓轉化過程中的消長規律存在差異,且糞污中 Cu 的殘留可導致蚯蚓轉化過程中多類 ARGs的富集,其累積總豐度整體呈現出 CF(未添加 Cu)＜T3(高濃度,1000mg/kg)＜T1(低 濃 度 ,100mg/kg)＜T2(中 濃 度 ,500mg/kg)的趨勢.

3.4 蚯蚓轉化牛糞過程中,牛糞基質理化因子的變化對 ARGs的消長起到了直接或間接的作用,其中pH值是影響ARGs增殖擴散的主要因子,通過明確該過程中ARGs變化的影響因素對于進一步優化牛糞-蚯蚓養殖環境、削減 ARGs豐度、抑制 ARGs的傳播有重要作用.