枸杞多糖抑制TGF-β1誘導的心肌成纖維細胞活化作用機制

馬治華，牛丕蓮，許惺博，張自萍，周學章，白明生,*

（1.寧夏大學生命科學學院，寧夏 銀川 750021；2.哥廷根大學醫學中心，德國 哥廷根 37075）

心血管疾病是非傳染性疾病中首要威脅人類健康的疾病，對個人和社會造成的負擔日益加重，有效防治心血管疾病是一個亟待解決的問題。心肌纖維化是各種心血管疾病發展至后期的共同病理特征，其主要特征是心肌成纖維細胞（cardiac fibroblasts，CFs）的分化和細胞外基質（extracellular matrixc，ECM）聚積。研究表明，轉化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）在纖維化和心肌重構中起著至關重要的作用。TGF-β1介導ECM的產生過程，可誘導CFs分化并促進膠原蛋白合成。因此有效抑制心肌纖維化可延緩心血管疾病后續的發生發展，有利于心血管患者的預后改善，為治療心血管疾病提供新方法。

近年來大量研究表明，中藥具有多途徑、多靶點的特點，對心肌纖維化的預防治療有獨特優勢，許多中藥復方、單味藥及其提取物對其均有顯著的防治作用。丹參酮IIA可通過TGF-β1/Smad信號通路逆轉心肌纖維化；黃連素能抑制TGF-β1誘導的心臟成纖維細胞增殖以及膠原蛋白合成；四逆湯是一種中藥復方，可干預腎素-血管緊張素系統，從而抑制心肌纖維化。

寧夏枸杞是我國傳統的藥食兼用名貴中藥材。枸杞果實中的活性成分有很多，包括枸杞多糖、黃酮、類胡蘿卜素、酚酸、甜菜堿、維生素等。研究發現，枸杞多糖是枸杞提取物中最主要的功能成分，枸杞多糖具有降血糖、降血壓、抗氧化、抗衰老、提高免疫力等生物學功能。然而，枸杞多糖對心肌纖維化影響的研究鮮有報道，本研究利用TGF-β1體外刺激小鼠CFs，建立心肌纖維化細胞模型，探究寧夏枸杞多糖對心肌纖維化的干預作用，為枸杞多糖在心血管類疾病的臨床治療中提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級C57BL/6新生小鼠，1～3 日齡，購于寧夏醫科大學實驗動物中心（生產許可證號：SCXK（寧）2020-0001）。

枸杞多糖（純度≥96%） 寧夏沃福百瑞公司。

DMEM/F12培養基、胎牛血清 美國Gibco公司；TGF-β1 美國Peprotech公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（鼠來源）、一抗Vimentin（兔來源） 賽信通（上海）生物試劑有限公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗北京中杉金橋生物技術有限公司；TritonX-100 生工生物工程（上海）股份有限公司；E.Z.N.A.Total RNA Kit I 美國Omega公司；HiScriptII Q RT SuperMix for qPCR、ChamQTM SYBRqPCR Master Mix試劑盒美國Vazyme公司；膠原蛋白I（collagen I，Col I）、膠原蛋白III（collagen III，Col III）酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒北京麗科生物有限公司。

1.2 儀器與設備

MDF-382E（N）超低溫冰箱 上海申力科技有限公司；Trans-Blot SD Cell酶標儀、TC20細胞自動計數儀美國Bio-Rad公司；E5311化學發光檢測儀 美國GE公司；W211電熱恒溫水浴鍋 北京長源實驗設備廠；Power pac HV電泳儀 北京凱元信瑞儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 C57BL/6小鼠CFs原代分離培養

參考劉夢昕等的方法分離培養原代CFs。用乙醚將C57BL/6新生小鼠麻醉后，在無菌條件下，用無菌剪刀和鑷子取心尖部位，快速置于含雙抗的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.2～7.6）洗3 遍。剔除結締組織，將心臟剪碎，加入適量胰酶，在37 ℃培養箱中，分次消化，每次5 min，共消化8～10 次。取上清液，并加入等量含體積分數10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM/F12培養基，混勻。過濾混合液，1 000 r/min離心5 min，收集沉淀于培養瓶中，在37 ℃、5% CO條件下培養90 min左右后，將未貼壁的細胞懸液吸出，此時已貼壁的細胞即為CFs，加入DMEM/F12培養基，放入培養瓶繼續培養。24 h后更換含10%胎牛血清DMEM/F12培養液，觀察CFs的生長情況。

1.3.2 CFs鑒定

采用免疫組化染色檢測纖維細胞標志蛋白Vimentin進行CFs鑒定。在無菌的12 孔板中爬片，待細胞貼片30 min左右，補加完全培養液，放于37 ℃、5% CO培養箱中培養12 h。取出，PBS漂洗，質量分數4%多聚甲醛溶液固定20 min后用PBS再次漂洗，體積分數0.5% Triton X-100處理15 min，PBS漂洗，體積分數3% HO處理15 min，PBS漂洗。室溫封閉60 min，取出甩干，一抗4 ℃過夜孵育，PBS洗3 次，二抗孵育60 min，PBS清洗，辣根過氧化物酶DAB顯色1～10 min，蒸餾水洗，蘇木素復染，自來水洗返藍。體積分數75%、85%、95%乙醇溶液和無水乙醇梯度脫水，二甲苯透明2 次，中性樹膠封片。免疫組化染色為棕黃色，結果為陽性，即為CFs。

1.3.3 細胞分組處理

取培養的CFs，每孔5×10個接種到6 孔板，待細胞貼壁后，實驗分為3 組：對照組（完全培養基）、模型組（質量濃度10 ng/mL TGF-β1）、枸杞多糖組（質量濃度10 ng/mL TGF-β1+質量濃度100 ng/mL寧夏枸杞多糖）。繼續培養48 h，進行后續實驗。

1.3.4 CFs形態及增殖情況觀察

CFs細胞分組處理培養4 d后，置于倒置顯微鏡下觀察其形態和數目，并進行拍照記錄。

1.3.5 免疫熒光法檢測α-SMA表達

待細胞生長至90%左右，以每孔1×10個細胞接種于6 孔板中，分組培養48 h后，質量分數4%多聚甲醛溶液固定10 min，取出玻片、固定，然后用100 μL 0.5% TritonX-100通透15 min，體積分數5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室溫封閉60 min，棄舊液，采用α-SMA一抗（（一抗）∶（抗體稀釋液）＝1∶500）37 ℃孵育2 h，熒光二抗（（二抗）∶（抗體稀釋液）＝1∶500）避光孵育1 h，PBS清洗，加入4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照，觀察綠色熒光強度。

1.3.6 膠原蛋白I和膠原蛋白III表達水平檢測

CFs分組培養48 h后，收集上清液，3 000 r/min離心20 min，收集上清液。按試劑盒說明書要求采用ELISA法檢測Col I、Col III表達量。

1.3.7 Western blot測定TGF-β1/Smads信號通路相關蛋白表達及磷酸化水平

采用細胞裂解液進行總蛋白提取并用BCA法對蛋白濃度定量，調整所有蛋白質量濃度為3 μg/μL，沸水煮10 min至變性。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將其轉移至聚偏氟乙烯膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，之后分別放于一抗actin、Smad2/3、p-Smad2、p-Smad3、Smad4（抗體稀釋比例為（一抗）∶（抗體稀釋液）＝1∶1 500），于4 ℃冰箱過夜孵育過夜，用1×TBST洗6 次（5 min/次），加入相應二抗（抗兔或抗小鼠，（二抗）∶（抗體稀釋液）＝1∶10 000）在室溫孵育1 h，1×TBST洗6 次（5 min/次）。用發光液A、B等體積混合，用ECL化學發光液于化學發光檢測儀中顯影，最后用Image J軟件對蛋白條帶相對灰度值進行分析。

1.3.8 纖維化調節轉錄因子、和的mRNA表達水平測定

收集各組細胞，按照試劑盒說明書提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，分別將cDNA、、和及基因引物加至實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）Mix反應體系中，進行qRT-PCR檢測。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列參考Song Shuai和戚曉琳等方法，序列如下：：F：5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’，R：5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’；引物序列：F：5’-GGGCTCTGAAGATGCACAT，R：5’-TGGCTTCTCACCAGTGTGGG-3’；引物序列：F：5’-CGCCTCCAAGAAGCCCAA-3’，R：5’-CTGGGTAAAGGAGAGTGGAGTGG-3’；引物序列：F：5’-TGATAGAAGTCTGAACACTCGTTTG-3’，R：5’-GGCTGATTGGCAAGACCTCT-3’；引物序列：F：5’-CCTCAGGGTATTGCTGGACAAC-3’，R：5’-CAGAAGGACCTTGTTTGCCAGG-3’。

1.4 數據處理與統計

采用GraphPad Prism5軟件用單因素方差分析對數據進行統計學分析并作圖，以＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 小鼠CFs鑒定結果

波形蛋白Vimentin為纖維細胞標志蛋白，為鑒定分離所得細胞是否為小鼠CFs，采用免疫組化檢測Vimentin。如圖1所示，分離所得細胞的免疫組化染色為棕黃色，結果為陽性，符合CFs特征，表明分離所得細胞為小鼠CFs，可用于后續實驗。

圖1 小鼠原代CFs免疫組化鑒定結果Fig. 1 Results of immunohistochemical identification of mouse primary CFs

2.2 枸杞多糖對TGF-β1誘導CFs形態的影響

如圖2所示，TGF-β1誘導后，CFs由梭形、不規則多邊形變得細長、狹長，枸杞多糖干預后，細胞形態有所恢復，表明枸杞多糖可使TGF-β1誘導的CFs形態變化有所改變。

圖2 形態學觀察枸杞多糖對TGF-β1誘導CFs的影響Fig. 2 Microscopic observation of the effect of Lycium barbarum polysaccharide on TGF-β1-induced CFs

2.3 枸杞多糖對TGF-β1誘導的CFs中α-SMA表達的影響

如圖3所示，與對照組比較，TGF-β1誘導后，細胞中α-SMA綠色熒光表達明顯增強，而枸杞多糖組相較于模型組，α-SMA綠色熒光表達明顯減弱。Western blot檢測結果與免疫熒光檢測結果一致。如圖4所示，與對照組比較，TGF-β1誘導后，細胞中α-SMA表達水平高度顯著上調（＜0.001），枸杞多糖干預后，α-SMA蛋白表達水平較模型組高度顯著下調（＜0.001）。結果表明在蛋白水平，枸杞多糖對TGF-β1誘導的α-SMA表達有抑制作用。

圖3 免疫熒光檢測枸杞多糖對TGF-β1誘導的CFs中α-SMA表達的影響（400×）Fig. 3 Immunofluorescence detection of the effect of Lycium barbarum polysaccharide on the expression of α-SMA in CFs induced by TGF-β1 (400 ×)

圖4 枸杞多糖對TGF-β1誘導的CFs α-SMA表達的影響Fig. 4 Effect of Lycium barbarum polysaccharide on the expression of α-SMA in CFs treated with TGF-β1

2.4 枸杞多糖對TGF-β1誘導的CFs中Col I、Col III蛋白表達的影響

如圖5顯示，與對照組相比，TGF-β1誘導后，細胞培養液上清中Col I、Col III蛋白質量濃度高度顯著增加（＜0.001），枸杞多糖干預后，Col I、Col III蛋白質量濃度均較模型組高度顯著減少（＜0.001），表明枸杞多糖可抑制TGF-β1誘導的Col I和Col III蛋白表達增加。

圖5 枸杞多糖對TGF-β1誘導的CFs Col I、Col III蛋白表達的影響Fig. 5 Effect of Lycium barbarum polysaccharide on the expression of Col I and Col III in CFs treated with TGF-β1

2.5 枸杞多糖對TGF-β1/Smads信號通路相關蛋白表達及磷酸化的影響

如圖6所示，與對照組比較，模型組中Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad4蛋白相對表達量均高度顯著上調（＜0.001），枸杞多糖組相較模型組，相關蛋白表達均呈高度顯著下調（＜0.001）。上述結果表明，TGF-β1成功激活TGF-β1/Smads信號通路，枸杞多糖可通過抑制TGF-β1/Smads信號通路的激活進而改善心肌纖維化。

圖6 枸杞多糖對TGF-β1誘導的CFs TGF-β1/Smads信號通路相關蛋白表達及磷酸化的影響Fig. 6 Effect of Lycium barbarum polysaccharide on the expression of TGF-β1/Smads signaling pathway-related proteins in CFs treated with TGF-β1

2.6 枸杞多糖對纖維化調節轉錄因子Snail 1、Snail 2、Twist和S100A4 mRNA表達的影響

如圖7所示，與對照組比較，模型組中/、和的mRNA相對表達量高度顯著增高（＜0.001）；與模型組比較，枸杞多糖組的/、和的mRNA相對表達量高度顯著下降（＜0.001）。表明枸杞多糖可改善心肌纖維化，與下調纖維化轉錄調節因子/、和表達有關。

圖7 枸杞多糖對TGF-β1誘導的CFs中Twist、S100A4、Snail 1/2 mRNA表達的影響Fig. 7 Effect of Lycium barbarum polysaccharide on the mRNA expression of Twist, S100A4, Snail 1/2 in CFs treated with TGF-β1

3 討 論

心臟組織受損時，機體啟動修復調節機制——心室重塑。心室重塑過程中形成的瘢痕可替代死亡的心肌細胞，從而起到修復受損心臟的作用，但當心臟持續發生心室重塑就會造成心肌纖維化。心肌纖維化發生時，CFs被活化，活化的CFs過度分泌ECM，ECM主要包括膠原蛋白和α-SMA等。研究表明，心肌纖維化是一個很復雜的病理過程，與許多因素相關。TGF-β1作為重要的促心肌纖維化生物因子之一，可以活化CFs。

寧夏枸杞的干燥成熟果實為藥材枸杞子，其味甘、性平，歸肝、腎經，有滋肝補腎、益精明目之功效，為茄科枸杞屬的一種多分枝小灌木。《中華人民共和國藥典》記載，寧夏枸杞成熟果實具有滋補肝腎、益精明目的功效，可用于治療虛勞精虧、眩暈耳鳴、陽萎遺精、內熱消渴、目昏不明等病癥。枸杞子中具有多種活性成分，如枸杞多糖、黃酮類化合物、生物堿、氨基酸等。研究表明，枸杞子中最具有提取利用價值的是枸杞多糖。本實驗中，TGF-β1刺激CFs后，細胞形態顯著變化，細胞數目增多且α-SMA的熒光表達顯著增強，Col I、Col III和α-SMA蛋白的表達上調；但加入寧夏枸杞多糖處理細胞后，對上述實驗現象起到抑制作用，表明寧夏枸杞多糖可抑制TGF-β1誘導的CFs活化。TGF-β1也可誘導特異性轉錄因子如、和的表達，進而促進纖維化的發生。研究表明，轉錄因子、和在纖維化發生中起重要作用。本實驗結果顯示，用TGF-β1刺激后，、和的mRNA表達增加；給予寧夏枸杞多糖處理細胞后，、和的mRNA表達呈下降趨勢。這表明寧夏枸杞多糖可有效抑制纖維化轉錄因子、和的mRNA表達。

TGF-β1是TGF-β1/Smads信號通路中關鍵因子。TGF-β1與其受體特異性結合，進而激活下游的Smads蛋白家族，發揮生物學效應，調節細胞內信號傳導。Smads蛋白家族與TGF-β1相互協調作用促使心肌纖維化。為進一步探究枸杞多糖如何改善心肌纖維化的發生，對TGF-β1/Smads信號通路相關蛋白表達水平進行檢測，發現TGF-β1可成功激活TGF-β1/Smads信號通路，使Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3和Smad4蛋白表達增多，枸杞多糖干預后，Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3和Smad4蛋白表達水平出現下調，表明枸杞多糖可能通過抑制TGF-β1/Smads信號通路的激活，進而減緩心肌纖維化的發生，改善心肌纖維化程度。

綜上所述，寧夏枸杞多糖可有效抑制TGF-β1刺激的CFs活化，降低纖維化轉錄因子、、的mRNA表達，從而促使心肌纖維化Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3和Smad4蛋白表達下調。本實驗結果表明枸杞多糖可通過抑制TGF-β1/Smads信號通路的激活，發揮改善心肌纖維化的作用。