ε-聚賴氨酸抗菌涂層制備及在淡水魚保鮮中的應用

王 瑞，王 宇，王一丞，段欣欣，雷 鵬，李 莎，谷益安，孫 良，羅正山，續曉琪，吳文錦，徐 虹,*

（1.南京工業大學食品與輕工學院，材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211816；2.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北 武漢 430064）

淡水魚營養豐富，附加值高，但因微生物、內源酶以及化學作用極易腐敗變質，極大限制了產品的銷售范圍，同時易引起食品安全重大隱患。近年來，具有抗菌功能的新型包裝材料引起廣泛關注?？咕b材料的制備方法主要分為兩種，一種是基于抗菌高分子材料如殼聚糖，對其進行改性成膜；另外一種是在傳統包裝材料成膜過程中添加抗菌劑如納米銀、鋅離子。以上方法一定程度上促進了抗菌包裝材料的發展，但仍然存在膜材料力學性能不穩定、抗菌劑逸出等問題，產業化進程緩慢。

基于現有包裝材料，對其表面進行抗菌功能化修飾是解決以上問題的有效途徑。目前市售保鮮膜主要成分為聚乙烯（polyethylene，PE）、聚氯乙烯（polyvinylchloride，PVC）、聚丙烯（polypropylene，PP）等，材料表面均表現為高疏水特性，導致表面容易黏附細菌并形成生物膜，進而引發細菌感染和食品腐敗。因此，開發簡單高效的膜表面抗菌涂層技術，賦予保鮮膜表面優異的抗菌性能，不僅具有重要的科學意義，而且具有巨大的實際應用價值。

-聚賴氨酸（-polylysine，-PL）是一種含有25～30 個賴氨酸殘基的新型綠色食品防腐劑，具有廣譜抗菌活性和良好的生物安全性，于2014年經衛生健康委員會批準作為新型食品防腐劑。-PL主要通過破壞細菌的細胞膜，從而破壞細胞結構，-PL進入細胞內使DNA受損，從而使細胞死亡，對食源性細菌如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有較高的抗菌活性。目前我國已經批準-PL作為食品防腐劑應用于焙烤制品、熟肉制品以及果蔬汁生產中。最重要的是，與其他殺菌劑相比，-PL對哺乳動物細胞沒有任何副作用。然而，-PL為高親水性聚合物分子，在酸性和中性條件下通過-氨基的質子化以聚陽離子形式存在，無法與疏水保鮮膜表面穩定附著，難以發揮抗菌功效，嚴重限制了其應用。

本研究以市售PE保鮮膜為基材，-PL和陰離子表面活性劑雙(2-乙己基)磺基丁二酸鈉（sodium bis(2-ethylhexyl)sulfosuccinate，AOT）為原料，采用一步靜電組裝技術，制備-PL-AOT復合物，該復合物不溶于水，可溶于乙醇，進而在保鮮膜表面形成穩定抗菌涂層（圖1）。通過對復合物分子結構及涂層理化性能進行表征，評價其穩定性；進一步以草魚魚片為研究對象，研究抗菌涂層對其實際保鮮效果，旨在為保鮮膜表面抗菌涂層在淡水魚保鮮應用提供理論依據和技術參考。

圖1 ε-PL-AOT抗菌涂層及抑菌機理示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the preparation of ε-PL-AOT antibacterial film

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活體草魚購于南京水產批發市場。

菌株：金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、大腸桿菌（ATCC 25922）由南京工業大學農業微生物實驗室提供。

LB培養基：將10 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、10 g NaCl、1 000 mL蒸餾水混合均勻，于121 ℃滅菌15 min，得到LB液體培養基，備用；LB固體培養基在LB液體培養基的基礎上加入培養基質量1.5%的瓊脂。

-PL（食品級，純度＞99%） 南京軒凱生物科技有限公司；AOT 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇天津市富宇精細化工有限公司；蒸餾水 湖南科爾頓水務有限公司；鹽酸 揚州滬寶化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

85-1型磁力攪拌器 金壇區白塔新寶儀器廠；XFP01-B型注射泵 蘇州訊飛科學儀器有限公司；FD-1A-50型真空冷凍干燥機 德國Marin Christ公司；TGL-16型臺式高速冷凍離心機 四川蜀科儀器有限公司；SK6210HP型超聲波清洗器 上?？茖С晝x器有限公司；LRH-150型生化培養箱 上海一恒科技有限公司；SW-CJ-2FD雙人超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；AV 400型核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance，NMR）儀 德國布魯克公司；Nicolet iS5型傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；ESCALAB MKII型X-射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）儀 英國VG公司；HLD數顯拉力計 樂清市艾德堡儀器有限公司；DSA100接觸角測試儀 德國克呂士公司；CH-1-S千分手式薄膜測厚儀 上海六菱儀器廠。

1.3 方法

1.3.1-PL-AOT復合物的合成與結構表征

將-PL溶于pH 2的鹽酸溶液中至-PL完全溶解，質量濃度為1.5 g/100 mL；同時將AOT溶于體積分數40%的乙醇溶液中至AOT完全溶解，質量濃度為3 g/100 mL。隨后，將AOT的乙醇溶液滴加至-PL溶液中，并攪拌反應，反應30 min，離心（10 000 r/min、15 min）并用超純水洗3 次，冷凍干燥12 h得到-PL-AOT復合物。利用H NMR對其分子結構進行鑒定，D-二甲基亞砜（(CD)SO）作為溶劑。

1.3.2 保鮮膜表面抗菌涂層構建

以普通市售保鮮膜為基材（PE保鮮膜，5 cm×5 cm），先在體積分數75%乙醇溶液中超聲清洗20 min，再用超純水洗10 min，室溫干燥備用。將-PL-AOT復合物溶解在無水乙醇中，得到2%（質量分數，下同）的-PL-AOT乙醇溶液，將該溶液噴涂于備用的PE保鮮膜表面，隨后取出常溫風干，乙醇揮發后即形成-PL-AOT復合物抗菌涂層（樣品記為PE/-PL-AOT）。同時，將2%的-PL乙醇溶液及AOT乙醇溶液分別噴涂到PE保鮮膜上，以其及PE保鮮膜作為對照樣（樣品分別記為PE/-PL、PE/AOT、PE）。

1.3.3 抗菌涂層的表征分析

采用傅里葉變換紅外光譜儀測定涂層成分的化學結構，掃描范圍為400～4 000 cm；利用XPS儀對涂層表面元素組成進行分析，檢測條件為：40 kV、50 mA、CuKα輻射、步寬0.02°、掃描范圍4°～70°；采用接觸角測試儀對涂層表面靜態水接觸角進行測定，設置滴加去離子水液體的體積為2 μL，通過CCD軟件記錄液滴形狀，并獲取所測得的接觸角；將膜進行裁剪成長方形（4 mm×25 mm），剪裁后用薄膜測厚儀測定裁好的膜中間處3 點的膜厚，取平均值即為膜厚；采用數顯拉力計進行膜拉伸實驗，拉伸速度為50 mm/min，觀察實驗曲線并記錄實驗數據，在室溫下測定本系列樣品膜的斷裂伸長率、拉伸強度，平行樣共3 個，結果取平均值。

1.3.4 涂層表面抗菌性能實驗

菌液制備：將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的單菌落接種至LB液體培養基中，培養12 h得到細菌菌液，離心（3 000 r/min、10 min）去除上清液，用滅菌好的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.2～7.4，下同）懸浮細菌濃度至1×10CFU/mL，隨后再用LB液體培養基將細胞稀釋到1×10CFU/mL。

抗菌定量實驗：采用JIS Z 2801標準對樣品中的活菌數進行統計。首先制備2 種保鮮膜基材（PE和PE/-PLAOT，5 cm×5 cm），并分別置于6 孔板中，在膜樣品表面中心區域，滴加20 μL上述細菌懸浮液，用PE保鮮膜和PE/-PL-AOT抗菌膜覆蓋，使得菌液均勻鋪展開。將帶有不同樣品的孔在37 ℃條件下孵化24 h，隨后將樣品取出，加入3 mL無菌PBS超聲2 min，使得黏附于樣品膜表面的細菌脫落，然后將其按照一定的倍數稀釋后，涂布平板。37 ℃過夜培養后，對表面形成的細菌菌落進行計數統計。

1.3.5 淡水魚肉保鮮效果評價

取新鮮活體草魚，敲擊致暈，宰殺后去頭、去內臟，取魚體兩側魚片。用預冷的無菌蒸餾水清洗后瀝干其體表水分，將魚背部白肉切成約4 cm×3 cm×1.5 cm魚塊。將其平均分成3 組，分別用PE保鮮膜和PE/-PL-AOT抗菌膜包裹，將處理后的樣品在37 ℃恒溫箱中放置24 h后，參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》中的平板涂布法對魚肉表面的菌落總數進行測定。

1.4 數據處理和分析

實驗均平行測定3 次，采用SPSS Statistic 17.0軟件對數據進行方差分析，＜0.05表示差異顯著，結果以平均值±標準差表示。采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 ε-PL-AOT復合物核磁氫譜結果

-PL與AOT兩者通過靜電相互作用及疏水相互作用可快速形成白色沉淀，該-PL-AOT復合物可溶解在乙醇溶液中，而不溶于水中。由圖2可知，在8.024處的峰是連接在氨基C上的質子峰（D，—C—NH）。在2.936處的峰則是連接C和N的亞甲基上的質子峰（B，C—CH—N）。另外，在0.858處的尖形分裂峰分別對應著AOT主鏈上甲基質子和支碳鏈上的甲基質子（H，C—CH）。各質子數目基本與預測結構符合，此外，通過各質子峰的面積之比，如AOT主鏈碳次甲基質子峰面積（2.301）約為-PL伯胺質子峰面積（1.000）的2 倍，可以看出-PL-AOT復合物是等物質的量反應形成的。

圖2 ε-PL-AOT的1H NMR圖譜Fig. 2 1H NMR spectrum of ε-PL-AOT

2.2 ε-PL-AOT涂層功能化抗菌保鮮膜

-PL-AOT為水不溶性復合物，因此利用乙醇溶解后噴涂于PE保鮮膜表面，隨后常溫風干，乙醇揮發后在保鮮膜表面形成復合物涂層。如圖3所示，-PL-AOT涂層處理的保鮮膜表面出現白色沉積物，但不影響保鮮膜本身的透明度，透光性較好。

圖3 抗菌膜的實體圖Fig. 3 Photograph of antibacterial film

2.3 ε-PL-AOT涂層紅外光譜結果

為了驗證-PL-AOT在保鮮膜表面形成了穩定涂層，采用紅外光譜對其表面分子結構進行表征。AOT磺酸根（—SO

）基團中S＝O鍵的對稱伸縮振動峰在1 051 cm左右，不對稱伸縮振動峰在1 300～1 100 cm左右。如圖4所示，PE/-PL-AOT樣品在1 046 cm處出現特征峰，為AOT中S＝O鍵的對稱伸縮振動，說明磺酸根與-PL氨根離子之間的電荷作用會使S＝O鍵的對稱伸縮振動峰發生藍移，該結果證實-PL-AOT在保鮮膜表面形成了穩定的涂層。

圖4 ε-PL-AOT復合物及其對照樣品涂層紅外光譜Fig. 4 Infrared spectra of ε-PL-AOT coating and control samples

2.4 ε-PL-AOT涂層元素分析結果

如表1所示，與PE保鮮膜相比，-PL-AOT涂層處理的保鮮膜表面N和S元素所占百分比明顯增加，-PL-AOT復合物通過與PE之間的疏水作用力在保鮮膜表面形成穩定涂層，因此結構中含有大量的N和S，證實PE膜表面-PL-AOT涂層的構建成功。PE保鮮膜、PE/-PL和PE/AOT表面以C元素為主，這是因為PE保鮮膜為聚乙烯組成，主要元素組成為C元素，-PL和AOT為水溶性，無法在保鮮膜表面形成穩定涂層。PE/-PL-AOT及其對照涂層表面元素組成的XPS譜如圖5所示。

表1 ε-PL-AOT及其對照組涂層的元素相對含量Table 1 Element contents of ε-PL-AOT coating and control samples

圖5 PE/ε-PL-AOT及其對照樣品的XPS譜圖Fig. 5 XPS spectra and high resolution XPS N 1s and S 2p spectra of ε-PL-AOT coating and control samples

2.5 ε-PL-AOT涂層表面親水性

涂層表面的親水性是判斷-PL-AOT涂層成功的另外一個關鍵指標。如圖6所示，因PE保鮮膜本身為疏水材料，表面接觸角為113.7°，PE/AOT和PE/-PL的接觸角與PE保鮮膜無明顯差異，證明涂層在水洗過程被洗掉，無法與膜表面穩定結合。而-PL-AOT涂層接觸角降至39.91°，親水性明顯增加，主要原因在于-PL-AOT通過疏水作用力與PE疏水表面相互作用形成穩定涂層，AOT的疏水烷烴鏈與PE分子形成穩定鍵合，-PL親水分子暴露在涂層上端，表現出高度的親水性。

圖6 ε-PL-AOT涂層及其對照樣接觸角測試Fig. 6 Contact angle of ε-PL-AOT coating and control samples

2.6 ε-PL-AOT涂層抗菌保鮮膜的力學性能分析結果

如表2所示，加入-PL-AOT對抗菌保鮮膜的厚度、拉伸強度和斷裂伸長率基本沒有影響，其中，相比較PE保鮮膜，抗菌保鮮膜的厚度沒有發生變化；而拉伸強度和斷裂伸長率雖稍有降低，但總體變化較小，對抗菌保鮮膜的力學性能影響較小?？傮w而言，在PE保鮮膜中加入-PL-AOT后，該涂層抗菌保鮮膜仍具有良好的力學性能。

表2 ε-PL-AOT涂層抗菌保鮮膜的力學性能Table 2 Mechanical properties of antibacterial film coated with ε-PL-AOT

2.7 ε-PL-AOT抗菌效果評價

2.7.1-PL-AOT抗菌涂層的抑菌效果

為驗證-PL-AOT抗菌涂層的抑菌效果，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為研究對象，對其抑菌率進行評價。如圖7所示，肉眼可直觀觀察到PE膜處理樣品和PE/-PL-AOT膜處理樣品的菌落數量具有明顯差異。由于PE膜無抗菌功能，24 h后表面大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌落數分別為6.78（lg（CFU/g））和6.87（lg（CFU/g））；而-PL-AOT抗菌膜表面細菌數量遠低于對照組，分別為2.94（lg（CFU/g））和2.73（lg（CFU/g）），證明了該涂層具有廣譜抗菌功能。其主要殺菌機制為接觸殺菌，涂層表面-PL分子接觸細菌時可以破壞細菌細胞膜的完整性，導致細胞膜通透性改變，細菌內容物泄漏，進而裂解死亡。

圖7 ε-PL-AOT抗菌涂層對大腸桿菌（A）和金黃色葡萄球菌（B）的抑制效果Fig. 7 Inhibitory effect of ε-PL-AOT antibacterial coating on Escherichia coli (A) and Staphylococcus aureus (B)

2.7.2-PL-AOT抗菌涂層對淡水魚保鮮效果

肉品腐敗變質的主要原因是微生物大量生長代謝導致蛋白質分解。如圖8所示，肉眼可直接觀察到3 種處理方式樣品的菌落數量有明顯差異，空白對照組（無保鮮膜）和PE保鮮膜處理組的細菌菌落總數均高于1×10CFU/g，根據GB 4789.2—2016，肉制品一級鮮度的菌落總數低于1×10CFU/g，其為變質肉。PE/-PL-AOT抗菌膜處理組表現出明顯保鮮效果，在平板上肉眼無可視菌落，菌落總數低于1×10CFU/g，滿足GB 4789.2—2016中肉制品一級鮮度標準，以上結果表明-PL-AOT抗菌涂層在淡水魚常溫保鮮領域具有很好的應用前景。

圖8 ε-PL-AOT抗菌涂層對魚肉保鮮效果Fig. 8 Effect of ε-PL-AOT antibacterial coating on total bacterial count of grass carp fillets

3 結 論

本研究以天然抗菌高分子材料-PL和表面活性劑AOT為原料，創新采用一步靜電組裝技術，制備穩定的保鮮膜涂層。該涂層對以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為代表的細菌具有顯著的抗菌性能，同時在以草魚魚肉為代表的淡水魚魚肉類保鮮中，也顯示出較好的延長貨架期性能。該技術解決了水溶性抗菌材料在疏水保鮮膜表面難以穩定附著的難題，對其他抗菌高分子材料如殼聚糖等的抗菌包裝材料開發具有指導意義；同時具有工藝簡單、抗菌功效顯著的優勢，在食品包裝領域具有廣闊的開發和應用前景。