生物信息學分析相同遺傳背景不同轉移潛能肺腺癌細胞系Anip973和AGZY83a分泌蛋白的比較定量蛋白質組學研究

高晴，劉贊

(1.東北國際醫院, 遼寧 沈陽 110623；2遼寧省檢驗檢測認證中心，遼寧 沈陽110000)

0 前言

肺癌是目前世界范圍內發病率和死亡率最高的腫瘤，我國肺癌的發病率及死亡率居所有惡性腫瘤首位[1]。肺癌患者早期癥狀不明顯，導致患者不能及早診斷和治療。原發性肺癌主要分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌兩大類，其中，非小細胞肺癌約占80%，肺腺癌約占32%-40%[2]。由于缺乏特異的臨床癥狀，僅僅表現為咳嗽、呼吸困難或者體重減輕等，75%的患者在就診是已經處于中晚期，由于其惡性度高，易復發，易轉移等特點，絕大多數患者的預后較差，生存時間不超過5年。為延長肺腺癌患者的生存周期，降低死亡率，研究肺腺癌的發生機制以及轉移的關鍵基因，更好的對患者進行早診顯得尤為重要。腫瘤的持續增長、轉移和侵襲依賴于腫瘤細胞和/或間質細胞在腫瘤微環境（Tumor microenviroment,TME）中交互作用。TEM是腫瘤存在的環境，包括腫瘤細胞、周圍血管和細胞外基質、其它非惡性細胞及信號分子[3-4]。目前的研究認為，腫瘤的持續生長、侵襲和轉移依賴于內環境中細胞分泌、分泌途徑和分泌蛋白對細胞微環境的交流和信息傳遞。并且，微環境中的腫瘤細胞和其它細胞分泌的細胞外基質成分和其它分子是腫瘤潛在標記物和治療藥物靶點的豐富來源[5]。基于質譜的蛋白質組學技術在過去的十年里發展迅速，在腫瘤標記物的篩選、分類、發生發展機制、治療和預后評估等方面承擔重要角色。多種標記物聯合檢測的靈敏度和特異度都較單一的標志物檢測更高[6]。比較蛋白質組學是對蛋白質組的整體進行分析，從蛋白質的表達水平、表達數量、修飾狀態上進行比較，得出蛋白質組見的差異，為腫瘤診斷標志物的篩選提供了全新的思路。同位素標記相對和絕對定量技術（Isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ）可同時對8個樣品進行直接定量比較，結合液相色譜質譜聯用技術（iTRAQ-LC-MS/MS），具有靈敏度高、適用范圍廣、特異性強、定量精準、重復性好等優點。目前，分子診斷以血清學為主，其中高豐度蛋白占99%，低豐度蛋白不足1%，低豐都蛋白雖然稀少，但腫瘤標志物主要儲存于這些蛋白中[7]。

分泌組（Secretome）是指從活細胞內合成，分泌到胞外起作用的蛋白質，參與細胞信號轉導、細胞間通訊、細胞遷移等過程。腫瘤細胞基因表達的改變和機體對腫瘤的反應均可引起釋放在腫瘤微環境中的分泌蛋白的表達異常，進而可能引起腫瘤的增值、分化、凋亡、轉移和侵襲[8]。研究肺腺癌病理改變導致的分泌蛋白表達的改變，對于我們篩選肺腺癌血清標志物、診斷和預后和療效檢測都有重要的意義。

本研究對同一來源的高低轉移能力的Anip973、AGZY83a 以及正常肺支氣管上皮細胞系的8-plex iTRAQ定量結果進行了比較蛋白質組學分析研究，以期發現肺腺癌轉移相關標志物，進一步篩選可用于肺腺癌預后及干預的潛在標志物。

1 材料與方法

1.1 細胞系與細胞培養

人肺腺癌細胞系Anip973與AGZY83a 細胞系購自上海拜利生物有限公司（https://www.bioleaf.com/），此兩株細胞于液氮中保存于哈爾濱醫科大學病理教研室。

Anip973、AGZY83a 、HBE細胞系于含表皮生長因子（rEGF）和牛垂體提取物(BPE)的無血清培養基中 (Invitrogen, formerly GIBCO-BRL, Cat. No.17005-042)在37℃、5% CO2的條件下孵育至細胞豐度達80%左右時，取培養基1500rpm離心，10分鐘后取上清進行分泌蛋白提取。

1.2 分泌蛋白提取

將收集的上清裝于透析袋(3500Da, Millipore,Billerica, MA, USA)分別在100mmoL、50 mmoL、25 mmoL、10 mmoL NaCL 透 析 液 中2h,4h,8h,12h進行梯度透析，最后放入兩蒸水中24小時之后放入-80℃過夜。過夜之后的固體狀態的透析液真空濃縮系統(Heto-Holten,Aller d, Denmark)12h-14h直至固體粉末狀態。

1.3 蛋白消化和iTRAQ 標記

將Anip973和AGZY83a 溶解于裂解緩沖液中[8M尿素(GibcoBRL)、4% CHAPS（Calbiochem)、10 mM DTT(Pro-mega)、1 mM PMSF (Amesco)、2mM EDTA (Ame-sco)]。DTT 10mM，56℃ 1h，IAM 55mM，避光45min，進行蛋白烷基化。酶（Promega）：蛋白質=1:30，37℃，共消化36小時，消化24小時之后，補加底物質量的1/100Trypsin。使用8-標iTRAQ 試劑盒（(AB Sciex, Foster City, CA, USA）進行樣本標記：將70μL異丙醇加到標記試劑中進行復融，并且消化的肽段標記于不同的iTRAQ 試劑上（Anip973 和AGZY83a分別標記117、119），室溫孵育2h，將3個樣本的肽段放入真空濃縮儀。

1.4 強陽離子交換

強陽離子交換(SCX)采用島津LC-6AD高效液相色譜泵系統，將在4mL緩沖液A(10 mMKH2PO4，25% ACN，pH 3.0) 消化的肽段加入4.6×250mm的Ultremex 強陽離子交換柱(Phenomenex)。肽段在A緩沖液中以1mL/min的流速進行梯度洗脫20min,采用逐步提高陽離子濃度的洗脫的方式將大部分肽段洗脫下來,洗脫下來的肽段分為12部分通過Strata X C18柱（Phenomenex）脫鹽并真空干燥。

1.5 液相色譜-串聯質譜分析

結合在線毛細管液相色譜系統(Famos,Switchos, Ultimate; Dionex, Amsterdam, Netherlands)，采 用micrOTOF-Q II (Bruker Daltonics, Bremen,Germany),進行肽組分的納米流電噴霧串聯質譜分析。

1.6 蛋白鑒定與定量

使 用MASCOT 軟 件（Mascot 2.3.01 software,Matrix-Science)進行數據分析，使用Swiss-Prot 57.15人類蛋白質序列數據庫（515,286 條序列），搜索時利用以下5個特異性參數：（1）肽和碎片離子的質量公差±0.5Da；（2）一個缺失的酶蛋白酶裂解；（3）氨基甲基半胱氨酸固定化修飾；（4）氧化變量；（5）iTRAQ 8標-復合物（K），iTRAQ 8標-復合物（N-末端），iTRAQ 8標-復合物（Y），氧化（M）。

1.7 信號肽預測與基因本體功能標記

將蛋白序列輸入 SecretomeP2.0 和SignalP4.0 servers (http://www.cbs.dtu.dk/services)預測蛋白的通路，使用AmiGO version 1.8 software (http://amigo.geneontology.org)預測差異分泌蛋白的功能，所分析的差異分泌蛋白分類為：細胞組成，分子功能和生物學過程。

1.8 免疫印記分析

RIPA裂解液裂解細胞或組織提取腎皮質組織全蛋白，取40μg上樣，在SDS-PAGE膠體中電泳分離，轉移至PVDF膜(300mA，100min)，含5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉60min，4℃過夜孵育一抗(ALPP稀釋比例分別為1:2000)，洗去未結合的一抗，加入HRP偶聯二抗(1:5000稀釋)室溫孵育60min，最后用ECL化學發光法曝光、顯影、定影，掃描膠片并保存數據。

2 結果與分析

2.1 iTRAQ實驗結果

為鑒定肺腺癌轉移相關血清標志物，iTRAQ標記的三株株細胞系Anip973、AGZY83和HBE的分泌蛋白經NCBI 數據庫共鑒定492個差異表達蛋白，當設置(117/119，117/113,119/113)取＞1.5或＜0.667并且至少含有一個特異性肽段時，Anip973與AGZY83a比較的差異蛋白表達共161個，Anip973與HBE比較的差異蛋白表達共86個，AGZY83a 與HBE比較的差異單蛋白表達共98個。經IPA 數據庫進行分析，與腫瘤遷移、血管生成、增值、黏附、侵襲相關的蛋白，見表1。

表1 IPA 數據庫腫瘤標記物富集

2.2 目的差異分泌蛋白的基因本體注釋

見圖1。

圖1 同一遺傳背景不同轉移能力的2株細胞系Anip973和AGZY83a差異蛋白表達的蛋白質組比較的細胞組分注釋、分子功能注釋、生物學過程注釋。

2.3 Western Blot 實驗結果

iTRAQ 實驗結果顯示，同一遺傳背景不同轉移能力的兩株細胞系Anip973和AGZY83a比較，ALPP蛋白在AGZY83a細胞系分泌蛋白中高表達（見圖2）。

圖2 ALPP蛋白在相同遺傳背景相同轉移能力不同的Anip 973細胞系和AGZY83a細胞系的分泌蛋白中的表達情況

續表1

3 討論

本實驗采用iTRAQ 標記定量的方法，比較兩株遺傳背景相同轉移能力不同的肺腺癌細胞肺癌細胞系Anip973和AGZY83a的分泌蛋白表達差異，以尋找肺腺癌轉移相關分子。

腺癌作為最常見的肺癌病理類型，約占到NSCLC的40%[9]。由于臨床癥狀隱匿，很多患者就診時已經為中晚期，有的已經發生遠處轉移，喪失手術機會，預后較差。隨著靶向藥與免疫治療的推廣應用，無法進行手術的晚期肺癌患者的5年生存率有所提高，目前早期診斷的手段主要采用低劑量計算機斷層掃描技術，這使得肺癌的早期診斷率有所提高。隨著蛋白質組學研究的進展，iTRAQ標記技術與高敏感性、高準確性的串聯質譜以及多為液相色譜聯用已經成為蛋白質定量、定性的主要研究工具。分泌蛋白可以通過復雜的途徑進入唾液、血液或者其它體液中并且可以用作唾液、血液、或其它體液檢測的蛋白標志物[10]。這些蛋白標志物的變化可以為檢測組織或者器官的生理狀態提供線索，對疾病做出及時的檢測和診斷。

本研究對鑒定的差異分泌蛋白進生物信息學分析，首要在IPA 數據庫分析了與遷移、轉移、血管生成、增殖、粘附以及侵襲相關的蛋白，并且選取了與白細胞遷移、腺癌、肝癌、膽管癌、性腺腫瘤、肺癌、子宮癌、生殖器腫瘤、宮頸癌、睪丸癌等腫瘤相關的ALPP 蛋白進行免疫印跡驗證。在肝腫瘤轉移的相關基因進行基因芯片研究結果表明，與對照細胞MOCK 細胞比較穩定轉染FATE/BJHCC-2的肝癌細胞5B4,出的差異蛋白中，ALPP基因表達量明顯下降[11]，這表明ALPP 在肝癌轉移中發揮這某種作用。本研究結果為ALPP 蛋白在相同遺傳背景的兩株不同轉移能力的肺腺癌細胞系Anip973 、AGZY83a 比較中，低轉移潛能細胞系AGZY83a 中表達月高轉移潛能細胞系Anip973的3倍，這表明，ALPP過某種機制抑制肺腺癌的轉移，其發揮作用的具體靶點以及相關機制有待于進一步的研究。