超高效液相色譜-串聯質譜法測定水產品中硝基咪唑類藥物及其代謝物

徐媛原，張 微，張 楊，李凱華，朱 穎，肖 曼，吳 丹，張 兵*

（1.深圳市質量安全檢驗檢測研究院，深圳 518055；2.廣東省市場監督管理局食用農產品監管重點實驗室，深圳 518055）

硝基咪唑類藥物作為抗生素和抗原蟲藥物，具有抗厭氧菌、廣譜、殺菌作用強、價格低和療效好等優點[1]，因此常被用于預防和治療畜禽以及水產動物的滴蟲病、球蟲病[2]。在畜禽和水產養殖過程中，常見的硝基咪唑類藥物主要為甲硝唑、地美硝唑和洛硝噠唑等，原藥在生物體內代謝為羥基化合物，主要為羥基甲硝唑（甲硝唑代謝產物）和羥甲基甲硝咪唑（地美硝唑和洛硝噠唑代謝產物）。硝基咪唑及其代謝物具有潛在的致癌性和致突變等毒性作用，長期濫用藥物后產生細菌耐藥性[3]，易造成動物源性食品殘留風險，因此歐美等發達國家已禁止在食源性動物中使用硝基咪唑類藥物[4]。我國GB 31650—2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》明確規定，甲硝唑和地美硝唑允許用于治療，不得在動物性食品中檢出，農業農村部公告第250號規定洛硝噠唑在食品動物中禁止使用，不得檢出。

目前，硝基咪唑類藥物及其代謝物主要檢測方法有酶聯免疫法[5]、高效液相色譜法[6-7]、氣相色譜-質譜聯用法[8-9]和液相色譜-質譜聯用法[10-15]等。我國也制定了一些相關檢測標準，如GB/T 21318—2007《動物源食品中硝基咪唑殘留量檢驗方法》，這類檢測方法前處理步驟繁雜，需多次提取、旋蒸、過柱等，消耗時間較多，且回收率偏低，不適宜大批量樣品檢測。本研究建立了簡便、快捷和高效的水產品中硝基咪唑類藥物及其代謝物的檢測方法，可大幅縮短檢測周期，節省人力物力成本，提高檢測效率，適用于大批量的實際樣品檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑與標準品

乙腈、甲醇和甲酸（色譜純），美國默克股份公司產品；超純水，Milli-Q超純水儀制得；固相萃取柱，Watses PRIME HLB 6 cc，200 mg。

分析標準品：甲硝唑、地美硝唑、洛硝達唑、羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑，純度均大于99%，購于德國Dr.Ehrenstorfre公司。

1.2 試樣準備

水產品的試樣準備按照GB/T 30891—2014規定執行，魚類取可食部分（肌肉和魚皮）絞碎混合均勻后備用，蝦類取可食部分（蝦肉）絞碎混合均勻后備用，貝類將樣品清洗后開殼剝離，收集全部的軟組織和體液勻漿后備用，于-18℃冷凍避光保存。實際樣品源自深圳市農貿市場、商超和電商等。

1.3 標準溶液配制

分別準確稱取10.0 mg按純度折算100%質量的甲硝唑、地美硝唑、洛硝達唑、羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑的標準物質，用甲醇溶解并定容至10.0 mL，配制濃度為1 000 μg·mL-1的標準儲備液，4℃冰箱避光保存。分別吸取上述標準儲備液1.00 mL用甲醇定容至10.0 mL，配制濃度為100 μg·mL-1的混合標準儲備液，逐級稀釋成10.0 μg·mL-1、1.00 μg·mL-1的混合標準工作液，4℃冰箱避光保存。

1.4 儀器設備

Agilent 1290Ⅱ超高效液相色譜串聯AB SCIEX三重四級桿5500質譜儀配備電噴霧離子源，美國Agilent科技有限公司和美國SCIEX公司產品；梅特勒PL602E電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產品；奧盛MTV-100自動試管振蕩器，杭州奧盛儀器有限公司產品；Sigma 3-30KS高速離心機，德國Sigma公司產品；N-EVAP-24型全自動氮吹儀，美國Organomation公司產品；Supelco visiprep SPE 24-port model固相萃取裝置，德國默克公司產品。

1.5 檢測方法

準確稱取2.50 g（精確到0.01 g）均質試樣于50 mL具蓋離心管內，準確加入10 mL 80%乙腈水提取液（含0.2%甲酸），2 500 r·min-1渦旋振蕩5 min，9 000 r·min-1離心5 min。吸取3.5 mL上清液直接過Watses PRIME HLB固相萃取柱，調整過柱速度，以1滴·s-1速度過柱，收集濾液于離心管中。準確吸取濾液2.5～5.0 mL帶刻度離心管內，在40℃水浴下氮氣吹至濾液少于0.5 mL，用10%甲醇水溶液（含0.1%甲酸）將殘留液定容至1.00 mL，2 000 r·min-1渦旋振蕩溶解殘留物1 min，溶解后的殘留物通過0.22 μm濾膜，液相色譜-質譜上機測定。

1.6 儀器條件

1.6.1 液相色譜條件

色譜柱：BEH C18（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：A為1%甲酸水溶液，B為甲醇；柱溫：40℃；進樣量：5.00 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.6.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子模式；檢測方式：多反應監測模式（MRM）；電噴霧電壓：5.5 kV；離子源溫度：550℃；氣簾氣壓力：35 psi；碰撞氣壓力：9 psi；噴霧氣壓力：55 psi；輔助加熱氣壓力：55 psi。以定性定量離子的豐度比和保留時間定性，以峰面積定量。硝基咪唑類及其代謝物的質譜參數見表2。硝基咪唑類及其代謝物的混合標準溶液MRM色譜圖見圖1。

表2 硝基咪唑類及其代謝物質譜參數

圖1 混合標準溶液MRM色譜圖

1.7 標準曲線

取不含待測物的空白魚肉樣品，分別添加硝基咪唑類及其代謝物（甲硝唑、地美硝唑、洛硝達唑、羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑）混合標準溶液，制得濃度為1.00、2.00、5.00、10.0和20.0 μg·kg-1的系列加標樣品，上述樣品按照1.5中的方法進行前處理，高效液相色譜串聯質譜測定，以硝基咪唑類及其代謝物各化合物色譜峰面積為縱坐標，各化合物的添加濃度為橫坐標建立標準曲線。

1.8 加標回收率測定

分別向羅非魚、基圍蝦和花甲不含待測物的空白試樣中添加25 μL、75 μL濃度為100 μg·L-1混合標準工作溶液，25 μL濃度為1.00 μg·mL-1混合標準工作溶液進行1.00、3.00和10.0 μg·kg-13個濃度水平的陽性添加回收率測定，每個濃度水平平行測定6個樣品，所有試樣均按照1.5中的方法處理，分別計算甲硝唑、地美硝唑、洛硝達唑、羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑的檢出限、精密度和回收率。

2 結果與討論

2.1 標準曲線

以硝基咪唑類及其代謝物各化合物的特征離子質量色譜峰面積為縱坐標，添加濃度為橫坐標繪制標準曲線，結果見表3，可知在1.00～20.0 μg·kg-1線性范圍內，甲硝唑、地美硝唑、洛硝達唑、羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑的相關系數分別為r=0.999 3、r=0.999 7、r=0.999 4、r=0.999 4和r=0.999 5，各化合物特征離子質量色譜峰面積與相應加標回收濃度的線性關系良好。

表3 硝基咪唑類及其代謝物線性特征參數及檢出限

2.2 方法檢出限

以空白魚肉為基質，以最低添加濃度進行檢驗，根據GB/T 27417—2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》確定檢出限的方法，采用信噪比法評估檢出限，根據3倍信噪比確定該方法各項目的檢出限見表3，甲硝唑、地美硝唑、洛硝達唑、羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑的檢出限分別為0.211、0.191、0.123、0.137和0.266 μg·kg-1，表明該方法靈敏度較高。

2.3 回收率和精密度

本研究以空白羅非魚、基圍蝦和花甲為基質，按照1.5中的前處理方法分別對甲硝唑、地美硝唑、洛硝達唑、羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑進行1.00、3.00和10.0 μg·kg-13個濃度水平的回收率測定，每個濃度水平平行測定6個樣品，計算出各物質不同濃度水平的回收率及相對標準偏差，結果見表4。

表4 加標回收率和相對標準偏差（n=6）

由表4可知，該方法的回收率、精密度良好，在3個不同加標濃度水平下，甲硝唑、地美硝唑、洛硝達唑、羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑的回收率范圍分別為85.9%～106.0%、85.7%～106.1%、87.1%～105.6%、87.4%～105.4%、96.3%～106.2%，相對標準偏差范圍分別為3.2%～7.0%、3.9%～6.7%、3.7%～5.3%、3.6%～6.6%和3.4%～8.9%，各基質各項目均符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》的要求以及國標方法對該類物質的檢測分析要求。表明該方法精密度、靈敏度更高，檢出限低，適用于水產品中硝基咪唑類藥物及其代謝物的測定。

2.4 實際樣品檢測

將本研究建立的方法應用于檢測水產品中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留量。實際樣品采樣于深圳市農貿市場、商超和電商等。采集品種主要包括草魚、福壽魚、鱸魚、基圍蝦和花甲等鮮活水產品，采集數量共計10份。檢測結果顯示，在實際樣品中未檢測出硝基咪唑類藥物及其代謝物。

3 結論

本研究方法建立了水產品中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留量的超高效液相色譜-串聯質譜測定方法。該方法采用少量試劑提取，Watses PRIME HLB固相萃取柱凈化，與傳統的方法相比，無需消耗大量有機試劑，采用通過式固相萃取方式，無需進行活化、淋洗、洗脫等繁瑣步驟，極大地減少了試劑消耗，縮短了檢測時間，提高了檢測效率。本方法通過多種水產品基質驗證，結果表明前處理過程簡便和快捷，不僅極大縮短了檢測時間，提高了檢測效率，且該方法檢出限更低、精密度更高、定性定量更準確，適用于水產品中甲硝唑、地美硝唑、洛硝達唑、羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑的殘留量檢測。