重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗對白羽肉雞免疫效果研究

孫 心，李叔偉

（1.哈藥集團生物疫苗有限公司，哈爾濱 150040；2.齊齊哈爾大學，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

由H5和H7亞型禽流感病毒（AIV）引起的高致病性禽流感（HPAI）已被世界動物衛生組織列為一類動物疫病[1]。近年來，由于我國家禽養殖密度過大，生物安全措施不到位，防控意識不到位，從而造成了高致病性禽流感病毒頻頻出現變異，增加了防控難度。2021年高致病性禽流感發生率升高，H5亞型2.3.4.4d分支是目前影響我國部分地區養禽業的主要AIV，以2.3.4.4d分支為代表的是H5N6亞型。同時，目前禽流感H5N8亞型已在全球廣泛傳播，在歐洲國家以及美國均已檢出[2-4]，現在也嚴重危害我國養禽業。近年我國白羽肉雞雞群也開始發生高致病性禽流感，發生日齡多在30日齡以后，因母源抗體無法保護21日齡之后的雞群，白羽肉雞免疫高致病性禽流感疫苗是一個趨勢，尤其在秋冬季節免疫是必要的。本試驗應用重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗（H5N6 Re-13株和H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株）進行免疫監測，以掌握該疫苗的免疫效果，為今后高致病性禽流感疫苗在白羽肉雞上的應用提供數據。

1 材料

1.1 疫苗及試劑

重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗（H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株滅活疫苗，哈藥集團生物疫苗有限公司生產。

禽流感H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株以及H7N9 Re-4株抗原及陽性血清，購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所；紅細胞懸液（SPF級公雞紅血球），購自哈藥集團生物疫苗有限公司。

1.2 試驗動物

1日齡白羽肉雞3 300羽，平均體重50 g·羽-1，黑龍江省哈爾濱市某白羽肉雞養殖場提供，其中正常免疫雞群3 000羽，應激試驗用300羽。

2 方法

2.1 雞群抗體檢測試驗

3 000羽試驗雞隨機分為A、B、C、D 4組，每組750羽。A、B組在雛雞1日齡時分別接種重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗（H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株），免疫劑量分別是0.15 mL·羽-1和0.30 mL·羽-1；C、D組在雛雞7日齡時分別接種重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗（H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株），免疫劑量分別是0.30mL·羽-1和0.50mL·羽-1。雞群在同一管理條件下進行飼養。

A、B組雛雞在1日齡接種重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗前隨機抽取20羽，心臟采血，檢測母源抗體；分別在7、14、21、28、35、42日齡各組隨機20羽雞翅靜脈采血，離心制備血清，按照現行《中國獸藥典》附錄紅細胞血凝抑制試驗（HI）進行抗體效價檢測。C和D組雛雞7日齡接種疫苗，分別在7、14、21、28、35和42日齡各組隨機取20羽雞翅靜脈采血，離心制備血清，按照現行《中國獸藥典》附錄紅細胞血凝抑制試驗（HI）進行抗體效價檢測。待檢血清HI抗體效價≥4 lb為抗體合格。

2.2 應激試驗

300羽雛雞隨機分為A、B、C、D 4組，每組75羽，分別于不同日齡（1日齡、7日齡、1日齡、7日齡）接種不同劑量（0.15 mL、0.30 mL、0.30 mL、0.50 mL）的重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗（H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株），接種后觀察疫苗吸收時間及試驗雞的精神狀態、采食量，判斷該疫苗對雞群的應激情況。

3 結果與分析

3.1 重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗接種后的抗體消長規律

3.1.1 1日齡接種0.15 mL·羽-1

1日齡接種0.15 mL·羽-1疫苗后檢測試驗雞不同日齡的抗體效價，結果見表1和圖1。

表1 試驗雞1日齡接種0.15 mL·羽-1后各日齡的抗體效價 lb

圖1 試驗雞1日齡接種0.15 mL·羽-1后各日齡的抗體效價

1日齡白羽肉雞接種0.15 mL·羽-1H5+H7亞型三價滅活疫苗，監測結果顯示H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株、H7N9 Re-4株抗體效價在14日齡時達到4.8 lb、5.1 lb和5.1 lb，在42日齡分別達到7.2 lb、7.3 lb和7.2 lb。從結果看三價滅活疫苗1日齡免疫0.15 mL·羽-1后，可以保證白羽肉雞出欄時（42日齡左右）具有足夠的H5和H7抗體水平。

3.1.2 1日齡接種0.30 mL·羽-1

1日齡接種0.30 mL·羽-1疫苗后檢測試驗雞不同日齡的抗體效價，結果見表2和圖2。1日齡白羽肉雞接種0.30 mL·羽-1H5+H7亞型三價滅活疫苗，監測結果H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株、H7N9 Re-4株抗體效價在14日齡時分別為4.7 lb、5.1 lb和5.1 lb，在42日齡時分別為7.3 lb、7.3 lb和7.2 lb。從結果看三價滅活疫苗1日齡免疫0.30 mL·羽-1后，可以保證白羽肉雞出欄時（42日齡左右）具有足夠的H5和H7抗體水平。

表2 試驗雞1日齡接種0.30 mL·羽-1后各日齡的抗體效價lb

圖2 試驗雞1日齡接種0.30 mL·羽-1后各日齡的抗體效價

3.1.3 7日齡接種0.30 mL·羽-1

7日齡接種0.30 mL·羽-1疫苗后檢測試驗雞不同日齡的抗體效價，結果見表3和圖3。7日齡白羽肉雞接種0.30 mL·羽-1H5+H7亞型三價滅活疫苗，監測結果H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株、H7N9 Re-4株抗體效價在21日齡時分別為4.9 lb、4.8 lb和4.4 lb，在42日齡時分別為6.4 lb、6.6 lb和6.1 lb。從結果看三價滅活疫苗7日齡免疫0.30 mL·羽-1后，可以保證白羽肉雞出欄時（42日齡左右）具有足夠的H5和H7抗體水平。

圖3 試驗雞7日齡接種0.30 mL·羽-1后各日齡的抗體效價

表3 試驗雞7日齡接種0.30 mL·羽-1后各日齡的抗體效價lb

3.1.4 7日齡接種0.50 mL·羽-1

7日齡接種0.50 mL·羽-1疫苗后檢測試驗雞不同日齡的抗體效價，結果見表4和圖4。7日齡白羽肉雞接種0.50 mL·羽-1H5+H7亞型三價滅活疫苗，監測結果H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株、H7N9 Re-4株抗體效價在21日齡時分別為5.0 lb、4.8 lb和4.4 lb，在42日齡時分別為6.5 lb、6.7 lb和6.2 lb。從結果看三價滅活疫苗7日齡免疫0.50 mL·羽-1后，可以保證白羽肉雞出欄時（42日齡左右）具有足夠的H5和H7抗體水平。

圖4 試驗雞7日齡接種0.50 mL·羽-1后各日齡的抗體效價

表4 試驗雞7日齡接種0.50 mL·羽-1后各日齡的抗體效價 lb

3.2 不同日齡白羽肉雞接種重組禽流感H5+H7亞型三價滅活疫苗的應激反應

試驗雞應激反應情況見表5。

表5 不同日齡白羽肉雞接種重組禽流感H5+H7亞型三價滅活疫苗的應激反應

1日齡和7日齡白羽肉雞雞群接種不同劑量的重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗（H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株），從完全吸收時間、精神狀態和采食量方面來評價接種疫苗后雞群的應激狀況，結果表明接種最大劑量0.50 mL·羽-1時，疫苗對雞群應激影響是一過性的，1～2 d可以恢復。通過本試驗可以得出1日齡接種0.15 mL·羽-1H5+H7亞型三價滅活疫苗對雞群沒有應激反應，7日齡接種0.30 mL·羽-1H5+H7亞型三價滅活疫苗對雞群沒有應激反應。但在實際應用中，接種疫苗時雞群會受到飼養環境的影響，偶有雞只會出現一過性應激反應。

4 討論

4.1 免疫日齡選擇

近幾年高致病性禽流感在白羽肉雞雞群中的發生率持續增高，以往白羽肉雞由于生長周期短的原因，不接種重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗，往往依靠母源抗體來預防高致病性禽流感的侵襲，但母源抗體對于白羽肉雞只能保護到21日齡左右，而近兩年白羽肉雞發生高致病性禽流感多集中在30日齡以后，所以接種高致病性禽流感疫苗是目前有效預防白羽肉雞發生高致病性禽流感唯一有效方法，接種日齡是尤為關鍵的。目前白羽肉雞7日齡接種重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗是比較常見的，但是對于白羽肉雞的保護率有待進一步評估。我國早期使用的重組禽流感病毒H5+H7亞型二價滅活疫苗，在廣西就應用在白羽肉雞雞群中，免疫日齡為1日齡，從抗體監測結果看，免疫效果較為理想。白羽肉雞在現地疫苗免疫預防時，有些地區和省份，新城疫+H9二聯滅活疫苗、新城疫+H9+雞傳染性支氣管+雞傳染性法氏囊四聯滅活疫苗習慣在1日齡接種，所以白羽肉雞1日齡不接種重組禽流感病毒H5+H7亞型疫苗。正常在1日齡免疫滅活疫苗是十分謹慎的，因為雛雞有母源抗體的保護，所以容易造成母源抗體的干擾。本試驗選取1日齡和7日齡白羽肉雞分別接種重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗（H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株），并在7、14、21、28、35和42日齡進行抗體監測，結果表明1日齡和7日齡接種高致病性禽流三價滅活疫苗在21日齡后監測抗體效價，21、28、35和42日齡H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株和H7N9 Re-4株抗體效價，1日齡接種要高于7日齡接種的抗體效價，證明1日齡接種重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗受到母源抗體的干擾很低，而且從母源抗體降低后，在21日齡左右疫苗產生的抗體效價在4 lb以上，所以從白羽肉雞雛雞出殼到出欄，H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株和H7N9 Re-4株抗體效價都在4 lb以上，對于白羽肉雞整個生長周期都有保護力。

4.2 免疫劑量選擇

試驗在1日齡白羽肉雞接種0.15 mL·羽-1、0.30 mL·羽-1重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗，7日齡白羽肉雞接種0.30 mL·羽-1、0.50 mL·羽-1重組禽流感病毒H5+H7亞型三價滅活疫苗，從完全吸收時間、精神狀態和采食量方面來評價接種疫苗后對雞群應激狀況，1日齡接種最大劑量0.30 mL·羽-1、7日齡接種最大劑量0.50 mL·羽-1時，疫苗對雞群應激影響是一過性的，1～2 d可以恢復。通過本試驗可以得出1日齡接種0.15 mL H5+H7亞型三價滅活疫苗對雞群沒有應激反應，7日齡接種0.30 mL·羽-1H5+H7亞型三價滅活疫苗對雞群沒有應激反應。綜合比較1日齡和7日齡接種不同劑量H5+H7亞型三價滅活疫苗后抗體效價，1日齡接種0.15 mL·羽-1和0.30 mL·羽-1產生的抗體效價無明顯差異，7日齡接種0.30 mL·羽-1和0.50 mL·羽-1產生的抗體效價無明顯差異，選擇最佳接種劑量為1日齡接種0.15 mL·羽-1，7日齡接種0.3 mL·羽-1。