口腔鱗狀細(xì)胞癌遺傳變異數(shù)據(jù)庫(kù)

施雯靖，潘賢潤(rùn)，呂哲宇，詹超英，沈百榮*

(1. 四川大學(xué)華西醫(yī)院疾病分子網(wǎng)絡(luò)前沿科學(xué)中心 成都 610212；2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院 成都 610075；3. 四川化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院數(shù)字經(jīng)濟(jì)學(xué)院 四川 瀘州 646300)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是一種特發(fā)在口腔的惡性腫瘤，癌變的鱗狀細(xì)胞可發(fā)生在牙齦、硬腭、舌、頰粘膜、唇等器官，屬于頭頸部最惡性的腫瘤，超過(guò)50%的頭頸部癌癥為口腔鱗狀細(xì)胞癌[1]。2020 年，全球范圍內(nèi)口腔癌死亡病例177 757 例(占全部癌癥的1.8%)，新增病例377 713 例(占全部癌癥的2%)[2]，而超過(guò)90%的口腔癌為口腔鱗狀細(xì)胞癌[3]。盡管發(fā)病率和死亡率從1975 年起有所下降[4]，但目前沒(méi)有針對(duì)口腔癌的常規(guī)篩查測(cè)試或計(jì)劃，也沒(méi)有血液測(cè)試可以進(jìn)行診斷，幾乎一半口腔癌或口咽癌在首次診斷時(shí)已擴(kuò)散到淋巴結(jié)。2006 年，以EGRF 為靶點(diǎn)的西妥昔單抗被FDA 批準(zhǔn)用于治療口腔鱗狀細(xì)胞癌，是目前唯一可用于口腔鱗狀細(xì)胞癌的分子靶向療法[5]，西妥昔單抗的有效性與病人的遺傳和基因表達(dá)譜有關(guān)[6]。

煙草和酒精是口腔鱗狀細(xì)胞癌最強(qiáng)的兩個(gè)生活習(xí)慣相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素。文獻(xiàn)[7]指出，口腔癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)會(huì)隨著吸煙時(shí)間和每日吸煙頻率的增加而顯著增加。煙草中發(fā)現(xiàn)的許多化學(xué)物質(zhì)會(huì)直接破壞DNA，造成生長(zhǎng)失控。目前的研究并不確定酒精是否會(huì)直接損害DNA，但已經(jīng)有研究證明，酒精有助于許多破壞DNA 的化學(xué)物質(zhì)更容易進(jìn)入細(xì)胞[8]，并且酗酒和大量吸煙的人患口腔癌的風(fēng)險(xiǎn)比不吸煙不喝酒的人高30 倍[9]。遺傳突變決定了部分人對(duì)某些類型的致癌化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分解的能力較差，因此他們對(duì)煙草、酒精和某些工業(yè)化學(xué)品的致癌作用更為敏感。文獻(xiàn)[6]提出與非OSCC 的頭頸癌和其他鱗狀細(xì)胞癌相比，HRAS 和PIK3CA 是唯一顯著突變的致癌基因，并且此類突變的分布在具有不同風(fēng)險(xiǎn)習(xí)慣(吸煙、過(guò)度飲酒或嚼檳榔)的人群中也是不同的。

2011 年，文獻(xiàn)[10]發(fā)布了口腔癌相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫(kù)OCDB v.2，包括了374 個(gè)基因。但其相關(guān)性的可信度不足，數(shù)據(jù)庫(kù)中并不能提供明確的報(bào)道證實(shí)某一基因與口腔癌相關(guān)。該數(shù)據(jù)庫(kù)的初始版本距今已過(guò)十年，數(shù)據(jù)在此期間沒(méi)有進(jìn)行更新。文獻(xiàn)[11]建立了哥本哈根口腔鱗狀細(xì)胞癌數(shù)據(jù)庫(kù)，但該研究重點(diǎn)關(guān)注患者的臨床信息，沒(méi)有收錄關(guān)于基因或突變方面的數(shù)據(jù)，且出于隱私保護(hù)的考慮，該數(shù)據(jù)庫(kù)并未公開發(fā)表。文獻(xiàn)[12]于2021 年發(fā)表了口腔癌基因組變異數(shù)據(jù)庫(kù)dbGENVOC，但其數(shù)據(jù)僅包括325 名印度口腔癌患者和手動(dòng)整理出版文獻(xiàn)中的118 名患者數(shù)據(jù)，同時(shí)只簡(jiǎn)單納入了變異的描述信息，對(duì)患者沒(méi)有任何描述。遺傳變異與疾病的關(guān)系并不是單一的，在不同的患者間也存在異質(zhì)性的問(wèn)題。因此，上述3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)臨床的參考與應(yīng)用價(jià)值有限。對(duì)于目前已有的遺傳變異數(shù)據(jù)庫(kù)，如Clinvar和OMIM，盡管它們包含的疾病種類非常全面，但并未收錄研究對(duì)象的臨床信息，也就無(wú)法直接在臨床上利用其數(shù)據(jù)。

精準(zhǔn)醫(yī)療和數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的第四科學(xué)研究范式的發(fā)展[13]，需要基因組學(xué)和臨床組學(xué)融合的數(shù)據(jù)。本文通過(guò)把碎片性的口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)遺傳變異與對(duì)應(yīng)的臨床信息融合起來(lái)，構(gòu)建了口腔鱗狀細(xì)胞癌遺傳變異數(shù)據(jù)庫(kù)(the OSCC genetic variation database,GVDoscc) (http://sysbio.org.cn/GVDoscc)。為 口 腔領(lǐng)域的相關(guān)工作者提供了高質(zhì)量的開源數(shù)據(jù)集。

1 材料方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

從美國(guó)國(guó)家生物信息技術(shù)中心(the national center for biotechnology information, NCBI)建立的Pubmed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)使用檢索詞“(Oral Squamous Cell Carcinoma[ti] OR OSCC[ti])NOT review[ptyp] AND English[LA] AND (1991/01/01[DP]: 2021/7/1[DP])”獲取英文非綜述類文獻(xiàn)6 137 篇，作為本文的數(shù)據(jù)源。

1.2 技術(shù)路線

數(shù)據(jù)庫(kù)的收集、搭建流程和功能簡(jiǎn)介如圖1 所示，從Pubmed 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取到口腔鱗狀細(xì)胞癌的相關(guān)文獻(xiàn)后，利用PubTator 對(duì)全文中的基因或突變進(jìn)行注釋。PubTator 是一種網(wǎng)絡(luò)服務(wù)工具，為基因與蛋白質(zhì)、遺傳變異、疾病、化學(xué)物質(zhì)、物種和細(xì)胞系提供來(lái)自文本挖掘系統(tǒng)的自動(dòng)注釋[14]。若整篇文章中都未曾出現(xiàn)一次基因或突變的名稱，則刪去此文獻(xiàn)；然后對(duì)篩查得到的3 884 篇文獻(xiàn)進(jìn)行人工注釋，并對(duì)Pubtator 的注釋進(jìn)行二次核查。數(shù)據(jù)庫(kù)采用B/S 結(jié)構(gòu)(Browser/Server，瀏覽器/服務(wù)器模式)，用戶可以通過(guò)瀏覽器直接進(jìn)行訪問(wèn)，前端網(wǎng)頁(yè)由html 和JavaScript 完成，后端服務(wù)器采用Apache搭建而成，PHP 用于連接后臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在MySQL 數(shù)據(jù)庫(kù)中。用戶可以通過(guò)在線訪問(wèn)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)進(jìn)行分類瀏覽或檢索自己需要的信息，統(tǒng)計(jì)頁(yè)面也提供了對(duì)所有收錄數(shù)據(jù)的整體統(tǒng)計(jì)，用戶還可以在提交頁(yè)面上傳新數(shù)據(jù)，經(jīng)管理員審核通過(guò)后，將會(huì)被添加進(jìn)數(shù)據(jù)庫(kù)中。

圖1 GVDoscc 數(shù)據(jù)庫(kù)搭建流程

1.2.1 篩選標(biāo)準(zhǔn)

本研究在文獻(xiàn)初篩后，基于人工閱讀方式，采用以下納入和排除標(biāo)準(zhǔn)對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行篩選。

納入標(biāo)準(zhǔn)。1) 在Pubmed 數(shù)據(jù)庫(kù)中公開發(fā)表的有關(guān)口腔鱗狀細(xì)胞癌遺傳變異的流行病學(xué)研究；2) 具有臨床上確診為口腔鱗狀細(xì)胞癌的患者及其對(duì)照樣本信息。

排除標(biāo)準(zhǔn)。1)評(píng)論、社論等不予收錄；2)病例報(bào)告所包含的樣本量太少，不具有普適性，不予收錄；3) 綜述及meta 分析文章，追溯文中數(shù)據(jù)來(lái)源原文按納入排除標(biāo)準(zhǔn)處理。

1.2.2 數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)構(gòu)

數(shù)據(jù)庫(kù)主要由3 張實(shí)體表和1 張關(guān)系主表(Main)組成，實(shí)體表包括樣臨床樣本表(Sample)、參考文獻(xiàn)表(Reference)以及變異表(Mutation)。具體描述如下。

樣本表：樣本編號(hào)(Sample ID)、試驗(yàn)對(duì)象年齡(Age)、試驗(yàn)對(duì)象國(guó)籍(Country)、試驗(yàn)人數(shù)(Size)、性別(Gender)、樣本來(lái)源(Source)；

參考文獻(xiàn)表：PMID(該文獻(xiàn)在Pubmed 中的編號(hào))、發(fā)表年份(Year)、文獻(xiàn)題目(Title)、作者(Author)和期刊名(Journal)；

變異表：變異編號(hào)(Mutation ID)、變異分類(Classification)、變異名稱(Name)、變異位點(diǎn)(Position)、堿 基 變 化(Base variation)、變 異 結(jié) 果(Consequence)、基因(Symbol)、基因所在位點(diǎn)(Gene location)、氨基酸變化(Amino Acid variation)；

主表：數(shù)據(jù)唯一的主編號(hào)(Main ID)、變異所導(dǎo)致的病理作用(Pathological Function)、臨床特征(Clinical Significance)、臨床應(yīng)用(Application)、患者的變異頻率(Patient-frequency)、對(duì)照的變異頻率(Control-frequency)、結(jié)論(Summary)。

1.3 生物信息學(xué)分析

1.3.1 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

String 數(shù)據(jù)庫(kù)旨在收集、評(píng)分和整合所有公開可用的蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)相互作用信息來(lái)源，并通過(guò)計(jì)算預(yù)測(cè)來(lái)補(bǔ)充這些信息。String 目前版本為v11.5，已收錄人類(Homo sapiens)的19 303 個(gè)蛋白[15]。將收錄的基因映射到String 數(shù)據(jù)庫(kù)中(置信度>0.9)，構(gòu)建了蛋白質(zhì)互作(protein protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)Cytoscape 計(jì)算節(jié)點(diǎn)的度中心性，以降序排列，取前5%為關(guān)鍵基因。Cytoscape 是一個(gè)專注于網(wǎng)絡(luò)可視化和分析的開源軟件項(xiàng)目，用于將生物分子交互網(wǎng)絡(luò)、高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)和其他的分子狀態(tài)信息整合在一起[16]。

1.3.2 功能富集分析基因本體(gene ontology, GO)是一個(gè)在生物信息學(xué)領(lǐng)域中廣泛使用的本體，包含了生物學(xué)領(lǐng)域知識(shí)體系本質(zhì)的表示形式，從基因的分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞組分這3 方面對(duì)目標(biāo)進(jìn)行注釋[17]。GO可用于系統(tǒng)分析和標(biāo)注基因產(chǎn)物的功能；KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)則是用于分子水平信息，尤其是基因組測(cè)序等高通量生成的大規(guī)模數(shù)據(jù)集，來(lái)了解細(xì)胞、生物和生態(tài)等生物系統(tǒng)的高級(jí)功能和效用[18]；KEGG 的通路數(shù)據(jù)庫(kù)可用于系統(tǒng)層次的疾病機(jī)制的分析。在數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建的基礎(chǔ)上，本文對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因進(jìn)行了GO 富集分析(P值<0.05)和KEGG 通路富集分析(P值<0.05，富集倍數(shù)>2)。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

在經(jīng)過(guò)上述的篩選和整理后，本文共收錄了1 020種口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)遺傳變異，涉及到436 個(gè)蛋白編碼基因和18 個(gè)miRNA 基因，相關(guān)臨床樣本總數(shù)為82 863 個(gè)。其中，明確標(biāo)明為男性和女性的分別為44 475 個(gè)和15 169 個(gè)，具體數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見表1。其中，部分樣本數(shù)據(jù)沒(méi)有注釋性別，導(dǎo)致男性樣本和女性樣本人數(shù)之和小于樣本總?cè)藬?shù)。

表1 數(shù)據(jù)庫(kù)基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

根據(jù)在原始試驗(yàn)中，該遺傳變異參與的正常生物學(xué)過(guò)程、病理過(guò)程及治療干預(yù)藥理學(xué)反應(yīng)，將其按生物標(biāo)志物類型分為診斷、治療和預(yù)后3 類(8%、29%、30%)，其中，非單一類型的生物標(biāo)志物(占診斷、治療和預(yù)后的2 種及以上)共182 個(gè)，占33%。

2.2 網(wǎng)頁(yè)設(shè)計(jì)

按照數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)構(gòu)和應(yīng)用需求，本文設(shè)計(jì)了7 個(gè)在線使用的功能模塊：網(wǎng)頁(yè)基本介紹、分類瀏覽、高級(jí)檢索、統(tǒng)計(jì)結(jié)果展示、數(shù)據(jù)提交、用戶幫助和管理維護(hù)。

基本介紹：對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的內(nèi)容進(jìn)行基本介紹，展示引用相關(guān)資源、相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)和研究機(jī)構(gòu)網(wǎng)址等信息。

分類瀏覽：用戶可根據(jù)3 種分類方式(變異類型、臨床樣本來(lái)源、突變的相關(guān)基因分類等)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行瀏覽。

高級(jí)檢索：用戶根據(jù)突變名稱、數(shù)據(jù)來(lái)源(地點(diǎn))、基因名稱等條件檢索需要的信息。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果：主要由遺傳變異的分類、頻率排前10 位的基因、突變?cè)谌旧w上分布和臨床樣本來(lái)源的地理位置分布熱圖組成。

數(shù)據(jù)提交：用戶只需填寫4 個(gè)條目，包括突變名稱、參考文獻(xiàn)、聯(lián)系郵箱和細(xì)節(jié)，即可提交新數(shù)據(jù)，其中突變名稱與郵箱為必填項(xiàng)。在審核成功后，系統(tǒng)會(huì)將新的數(shù)據(jù)添加進(jìn)本數(shù)據(jù)庫(kù)中。

用戶幫助：詳細(xì)介紹了數(shù)據(jù)庫(kù)的操作方式，確保用戶能夠正確查找到自己需要的信息。

管理維護(hù)：對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行更新與維護(hù)，更新間隔保持在3～6 個(gè)月，在數(shù)據(jù)更新時(shí)，相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)也會(huì)進(jìn)行更新。

2.3 生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.3.1 PPI 分析結(jié)果

首先將收錄的436 個(gè)編碼基因通過(guò)String 映射到PPI 網(wǎng)絡(luò)中，成功映射了256 個(gè)節(jié)點(diǎn)與1 085 條關(guān)系。通過(guò)度中心性，共篩選出了12 個(gè)關(guān)鍵基因，如圖2 與表2 所示，包括PIK3R1、TP53、PIK3CA、MAPK1、HRAS、AKT1、KRAS、RHOA、MYC、EGFR、RELA 以及NRAS。

表2 關(guān)鍵基因在OSCC 中的功能

圖2 口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)基因所構(gòu)成的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.3.2 功能富集分析結(jié)果

將收錄的基因進(jìn)行GO 富集分析，得到了549 個(gè)生物過(guò)程、63 個(gè)細(xì)胞組分和106 個(gè)分子功能。在經(jīng)過(guò)KEGG 通路分析后，得到了118 個(gè)相關(guān)通路，對(duì)上述4 種分析方式的前10 條結(jié)果按基因數(shù)目降序排列，見表3～表6。

表3 根據(jù)基因數(shù)目排列的前十位生物過(guò)程

表4 根據(jù)基因數(shù)目排列的前十位細(xì)胞成分

表5 根據(jù)基因數(shù)目排列的前十位分子功能

表6 根據(jù)基因數(shù)目排列的前十位KEGG 通路

由表3 可見，富集最多在RNA 聚合酶II 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(17.59%)上，RNA 聚合酶II 的作用是催化DNA 轉(zhuǎn)錄，合成mRNA 及大多數(shù)hnRNA和miRNA 的前體；細(xì)胞組分：超過(guò)30%的基因富集在細(xì)胞核(43.43%)、細(xì)胞質(zhì)(37.42%)和細(xì)胞膜(32.74%)上；分子功能：富集結(jié)果都與結(jié)合密切相關(guān)，其中蛋白結(jié)合(64.14%)上在此次分析中富集的基因最多，牽涉了288 個(gè)基因。在經(jīng)過(guò)KEGG通路分析后發(fā)現(xiàn)基因顯著富集在癌癥途徑(pathways in cancer)上，并且參與了PI3K-Akt 信號(hào)通路和黏著斑(focal adhesion)。

3 結(jié) 束 語(yǔ)

基于基因表達(dá)模式的分類表明，OSCC 可以分為不同的亞型，文獻(xiàn)[19]通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn)在不同OSCC 亞型中，EGFR、MTDH 和ERCC1 的表達(dá)水平存在顯著的差別。文獻(xiàn)[20]發(fā)現(xiàn)不同的腫瘤亞型對(duì)不同類型的療法存在優(yōu)先反應(yīng)[20]。因此，需要高質(zhì)量的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)對(duì)患者的免疫狀態(tài)進(jìn)行精確判斷，本文將Pubmed 中碎片化的結(jié)論收集起來(lái)，基于1991?2021 年間的334 篇文獻(xiàn)中的1 020 條遺傳變異數(shù)據(jù)，構(gòu)建了一個(gè)全面、專業(yè)的口腔鱗狀細(xì)胞癌數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)變異進(jìn)行分類和對(duì)樣本信息進(jìn)行歸納。在生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，PPI 的關(guān)鍵基因包括PIK3、RAS 家族和基因TP53 等。PI3K 參與的PI3K-Akt 通路，調(diào)節(jié)了細(xì)胞的增殖分化、凋亡等多種功能，在KEGG 同樣也被富集，其過(guò)度活化與人體腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[21]，早在2006 年就有第一個(gè)新型PI3K 抑制劑開始了臨床試驗(yàn)[22]；RAS基因的突變存在于30%的人類惡性腫瘤中，其功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化增殖，被稱為細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)傳遞中的“分子開關(guān)”[23]；p53 作為TP53 基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物，在人類惡性腫瘤中普遍存在[24]，被認(rèn)為是目前最重要的抑癌基因。GO 分析結(jié)果主要富集在細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控、基本組成結(jié)構(gòu)(細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì))上，說(shuō)明此類基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展或轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

癌癥是復(fù)雜的、異質(zhì)的和動(dòng)態(tài)的疾病，將腫瘤的基因分析與個(gè)體生理狀態(tài)的深度縱向分析(深度表型)相結(jié)合是預(yù)防、診斷和治療癌癥的關(guān)鍵，而挖掘深度表型首先需要提高診斷的精度[25]。從建模的角度，可以通過(guò)對(duì)不同的生物標(biāo)志物進(jìn)行組合和建模，提高預(yù)測(cè)口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生和進(jìn)展的準(zhǔn)確性。未來(lái)將進(jìn)一步更新數(shù)據(jù)庫(kù)的內(nèi)容和結(jié)構(gòu)，同時(shí)基于數(shù)據(jù)庫(kù)建立知識(shí)圖譜和知識(shí)引導(dǎo)的模型，通過(guò)結(jié)合臨床研究、對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的基因變異異質(zhì)性進(jìn)行深度分析，為臨床的精準(zhǔn)診療提供數(shù)據(jù)和信息支撐。