辣椒中LACS家族基因鑒定及其對非生物脅迫的響應

賈切，劉亞博,*，王飛，姚明華，余楚英，沈勝,3，劉奕清,，李寧

1.長江大學園藝園林學院，長江大學香辛作物研究院，湖北 荊州 434025 2.蔬菜種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室，湖北省農業科學院經濟作物研究所，湖北 武漢 430064 3.海南大學園藝學院，海南 海口 570228

長鏈脂酰輔酶A合成酶(Long-Chain Acyl-Coenzyme A Synthetase，LACS)是ACS家族中的一類酶，在幾乎所有脂肪酸衍生分子的生物代謝途徑中都具有重要的作用[1]。LACS將游離脂肪酸酯化成酰基輔酶A，這是大多數脂肪代謝酶利用脂肪酸所必需的關鍵活化步驟。LACS通過2個步驟催化酰基輔酶A的形成。首先游離脂肪酸通過ATP的焦磷酸分解轉化為酰基-AMP中間體，稱為腺苷；然后腺苷酸酯的活性羰基碳與輔酶A的硫醇基團偶聯，釋放AMP和酰基輔酶A最終產物[2]。酶結合腺苷酸的形成機制在生物體中廣泛存在，這種機制上的相似性反映在酶的氨基酸基序的保守上，特別是一個基序(ProSite PS00455)非常保守，也是AMP-binding超家族所共有的氨基酸保守基序，此外AMP-binding超家族還有1個保守的ACS信號基序[1,3]。LACS家族成員的蛋白質序列中均具有AMP-binding結構域。

LACS在脂類生物合成中的作用在細菌[4,5]、酵母菌[6]、綠藻[7]、哺乳動物細胞[8]和植物[1,9-11]中被廣泛研究。在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中共鑒定出9個LACS基因，分別定位于擬南芥的不同細胞器中，均參與了脂肪酸衍生分子的生物合成途徑。AtLACS1～AtLACS3參與脂肪酸的跨膜移動和角質層生物合成[9,12-14]，AtLACS4和AtLACS9在內質網和葉綠體之間的脂質運輸中具有很強的重疊功能[15]，AtLACS1、AtLACS2、AtLACS4、AtLACS8和AtLACS9均與蠟質合成有關，并影響表皮脂質代謝[12,16]；AtLACS1和AtLACS9還參與種子油脂的合成，AtLACS6和AtLACS7參與脂肪酸的β-氧化[17]。AtLACSs的表達具有組織特異性，AtLACS5在花中特異表達[1]，AtLACS1、AtLACS2、AtLACS4和AtLACS9在的種子中表現出較高的表達水平。對大豆、向日葵等作物中LACS家族的研究表明，其在脂肪酸代謝、角質和表皮蠟合成、花粉涂層形成等多個生化過程中起著關鍵作用[11, 16, 18, 19]。此外，LACS基因在植物逆境脅迫中也具有重要作用，角質和表皮蠟質的積累有助于提高植物對滲透脅迫、病原菌侵染等的耐受性[20-22]。與其他作物相比，在辣椒中LACS家族基因的功能尚不明確。本研究擬利用生物信息學分析方法在辣椒全基因組范圍內鑒定CaLACS基因家族，分析其染色體定位、系統進化、基因結構、保守基序等，并分析CaLACS基因在辣椒不同組織和非生物逆境脅迫下的表達模式，以期為后續利用分子生物學手段深入研究CaLACS基因家族在辣椒脂代謝及非生物脅迫中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 辣椒CaLACS基因家族的鑒定

從茄科作物基因組網站SGN(https://solgenomics.net/)下載辣椒‘Zunla-1’參考基因組信息，Ensembl Plants在線數據庫下載擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)參考基因組信息。在Pfam數據庫中下載LACS基因家族保守結構域AMP-binding(PF00501)的種子序列，利用HMMER3.0軟件對‘Zunla-1’基因組功能注釋的蛋白質序列進行本地化檢索。對所得的結果分別在Pfam(http://pfam.xfam.org/)和SMART數據庫(http://smart.embl-heidelberg.de/)進行結構域預測，選擇具有AMP-binding結構域的成員進行后續分析。

1.2 CaLACS蛋白質理化性質分析、染色體定位

利用ExPASy ProtParam在線程序(https://web.expasy.org/protparam/)對篩選到的基因進行氨基酸數目、分子量和等電點等理化性質預測。通過Cell-PLoc在線程序(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/)對CaLACS基因進行亞細胞定位預測。憑借Sequence Manipulation Suite在線程序(http://www.detaibio.com/)對CaLACS蛋白質親水性進行分析。根據辣椒‘Zunla-1’基因組文件信息，利用TBtools軟件[23]對辣椒CaLACS基因家族進行染色體位置分析。

1.3 進化樹、基因結構和保守基序分析

利用Cluster omega在線程序(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)，進行蛋白質序列的多重序列比對分析、構建鄰接樹，研究辣椒與雙子葉植物擬南芥和單子葉植物水稻間LACS基因家族的進化關系。根據參考基因組GFF3文件，分析CaLACS的基因結構。利用MEME(http://meme-suite.org/)軟件分析辣椒CaLACS基因家族成員保守基序(motif)類型和排列順序，獲得基因家族基序特點。利用GeneDoc(Version 2.7)軟件繪制多重序列比對圖，TBtools軟件[23]繪制相關基因結構和保守基因結構圖。

1.4 順式作用元件分析

提取CaLACS基因起始密碼子上游2000bp序列，提交至在線網站PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測基因啟動子區域順式作用元件，TBtools軟件[23]進行可視化分析。

1.5 基因表達模式分析

1.5.1 材料處理

將辣椒耐鹽自交系‘H1023’和鹽敏感自交系‘XWHJ-M’分別用清水噴施對照與0.25mol/L NaCl處理3h、3d后取樣，樣品液氮速凍后研磨成粉，于-80℃凍存備用。

1.5.2 熒光定量PCR分析

使用TRIzol試劑(Invitrogen，USA)提取總RNA。使用 HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Vazyme，南京)進行cDNA合成。使用Primer Premier 3.0在線軟件設計 qRT-PCR引物(見表1)，以辣椒CaUBI3為內參基因。使用ChamQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，南京)進行qRT-PCR反應。反應程序：95℃預變性30s，95℃變性10s，60℃退火30s和72℃延伸20s，40個循環。重復3次。采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量，使用TBtools軟件[23]繪制表達熱圖。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.5.3 轉錄組數據分析

辣椒‘6421’不同組織表達譜數據來源于PepperHub在線數據庫[24，25]，不同非生物脅迫處理(NaCl、低溫、熱脅迫)基因表達譜數據來源PepperHub在線數據庫。分析不同轉錄組試驗中CaLACS基因家族的表達模式，TBtools軟件[23]繪制表達熱圖。

2 結果與分析

2.1 辣椒LACS基因家族的鑒定、染色體定位與理化特征分析

以‘Zunla-1’為參考基因組從中共鑒定到10個CaLACS基因。在10個CaLACSs中，有7個基因被定位到辣椒辣椒1、3、4、7、8、9號染色體上(見圖1)，而CALACS1、CALACS2和CALACS3未被定位在染色體上。10個CaLACSs基因編碼區序列的長度在1215～2172bp之間，編碼的蛋白氨基酸數量在404～723之間，蛋白分子質量在45.34～79.47ku之間，等電點在6.13～8.81之間，蛋白親水性在-0.297～0.012之間，亞細胞定位預測大多數蛋白僅存在于過氧化物酶體中，CaLACS2編碼的蛋白還存在于葉綠體中(見表2)。

圖1 ‘Zunla-1’辣椒LACS基因家族的染色體定位Fig.1 Chromosome mapping of LACS gene family in pepper ‘Zunla-1’

表2 ‘Zunla-1’辣椒LACS基因家族的基本信息Table 2 Basic information of LACS gene family in pepper variety ‘Zunla-1’

2.2 辣椒LACS基因家族的系統進化與基因結構分析

構建辣椒和單子葉植物擬南芥、雙子葉植物水稻等28個LACS基因的系統發育樹(見圖2)，結果表明，3個物種的LACSs基因可劃分為8個亞家族：Group Ⅰ包括3個CaLACS基因，分別是CaLACS8、CaLACS10和CaLACS7；Group Ⅱ包括CaLACS6和CaLACS1，Group Ⅲ包括CaLACS4；Group Ⅴ和Group Ⅶ僅包含辣椒LACS基因，分別包含1個和3個CaLACS基因；Group Ⅵ和Group Ⅷ不包括辣椒CaLACS基因，Group Ⅵ只包含擬南芥AtLACS基因，而Group Ⅷ只包括水稻OsLACS基因；除Group Ⅲ中的CaLACS4和LOCOs05g04170位于同一分支外，總體上單、雙子葉植物的LACS形成了不同的亞組分支。

圖2 ‘Zunla-1’辣椒與擬南芥和水稻的LACS基因家族系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of LACS gene family in pepper ‘Zunla-1’ with Arabidopsis thaliana and rice

對CaLACS、AtLACS和OsLACS的基因結構和結構域分析表明(見圖3)，劃分在同一亞組的CaLACS、AtLACS和OsLACS的內含子和外顯子數目基本一致，區別主要體現在長度上；CaLACS、AtLACS和OsLACS的蛋白序列均具有LACS基因家族的保守結構域AMP-binding結構域(motif 5)、AFD class Ⅰ超家族。Group Ⅰ中LOCOs11g06880由motif 13和motif 3構成PLN02387結構域，其他成員由motif 16和motif 3構成PLN02387結構域；Group Ⅱ中成員均具有motif 17和motif 3構成的PLN02736結構域；Group Ⅲ中成員均具有motif 20和motif 3構成的PLN02430結構域；Group Ⅳ成員具有motif 20和motif 3構成的PLN02861結構域，Group Ⅴ、Group Ⅵ、Group Ⅶ與Group Ⅷ中除CALACS2由motif 8和motif 3構成PLN02614結構域與CALACS3由motif 13和motif 3構成PLN02614結構域外，其他成員均由motif 20和motif 3構成PLN02614結構域，說明CaLACS蛋白在進化上是高度保守的(見圖4)。

圖3 辣椒LACS家族的基因結構分析Fig.3 Gene structure analysis of LACS family in pepper

圖4 辣椒LACS基因家族的保守基序分析Fig.4 Analysis of conserved motifs of the LACS gene family in pepper

2.3 辣椒LACS基因啟動子區順式作用元件分析

對CaLACS基因家族成員的啟動子區順式作用元件進行分析，結果(見圖5)顯示CaLACS基因啟動子區具有G-Box、TATA-box和光響應元件，TC-rich repeats、LTR等響應逆境和防御脅迫等響應元件，以及TATC-box、TGACG-motif和ABRE等響應激素的元件，暗示CaLACS基因家族可能與非生物脅迫相關。

圖5 辣椒LACS家族的基因啟動子區順式作用元件分析Fig.5 Analysis of cis-acting elements in gene promoter region of pepper LACS family

2.4 辣椒CaLACS基因家族的組織表達分析

利用辣椒材料‘6421’在Pepper Hub網站的組織表達譜數據，分析CaLACS基因家族成員在不同組織和不同發育時期的表達情況。結果(見圖6)顯示，在幼葉期發育期、開花期和坐果早期CaLACS4的表達量最高；CaLACS1在種子發育后期的表達量較高，CaLACS7和CaLACS8在辣椒果實和胎座中的表達量較高。

注：L1～L9分別代表新葉剛現后2、5、10、15、20、25、30、40、50d；AL、AR、AS分別為成年植株葉、莖、根；F1～F9分別代表花蕾現蕾后2、5、10、15、20、25、30、40、50d；P10、O10、STA10分別代表完全開放花(F10)的花瓣、子房和雄蕊；FST0和FST1分別代表授粉3d、7d后含果肉種子胎座的整果；G1～G11分別代表授粉10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60d的果肉；ST1和ST2分別代表授粉10d和15d后的種子和胎座；S3～S11分別代表授粉20、25、30、35、40、45、50、55、60d的種子；T3～T11分別代表授粉20、25、30、35、40、45、50、55、60d的胎座。圖6 ‘6421’辣椒LACS基因家族在不同組織中的表達模式Fig.6 Expression patterns of LACS gene family from pepper ‘6421’ in different tissues

2.5 辣椒CaLACS基因家族在非生物脅迫下表達分析

利用Pepper Hub表達譜數據，對10個CaLACS基因在不同非生物逆境脅迫下葉片和根部組織的表達情況進行分析。結果(見圖7)顯示，NaCl脅迫下CaLACS1基因在處理12h時的葉片中顯著上調表達；CaLACS1和CaLACS2基因在根部均顯著受NaCl誘導表達，其中CaLACS2基因在NaCl脅迫3h時的根部中表達量最高。低溫脅迫處理下，除CaLACS5、CaLACS6和CaLACS9外均受低溫誘導在葉片中表達，其中CaLACS1基因在處理24h時的葉片中表達量最高；CaLACS2基因受低溫誘導在根部顯著表達，與對照0h相比，在處理1、1.5、3h和6h時的根部中均顯著上調表達。高溫脅迫下，CaLACS8基因在葉片和根部均受到誘導表達，在處理24h時的表達量最高；CaLACS2基因在高溫脅迫1h和3h時的根部中表達量較高。綜合CaLACS基因的表達譜數據推測，辣椒中CaLACS1和CaLACS2基因與非生物脅迫響應密切相關。

注：CK_L為葉片對照；CK_R為根對照；NL_1h、NL_1.5h、NL_3h、NL_6h、NL_12h、NL_24h分別代表NaCl脅迫處理1、1.5、3、6、12、24h后的葉片樣品；NR_1h、NR_1.5h、NR_3h、NR_6h、NR_12h、NR_24h分別代表NaCl脅迫處理1、1.5、3、6、12、24h后的根部樣品；FL_1h、FL_1.5h、FL_3h、FL_6h、FL_12h、FL_24h分別代表低溫脅迫處理1、1.5、3、6、12、24h后的葉片樣品；FR_1h、FR_1.5h、FR_3h、FR_6h、FR_12h、FR_24h分別代表低溫脅迫處理1、1.5、3、6、12、24h后的根部樣品；HL_1h、HL_1.5h、HL_3h、HL_6h、HL_12h、HL_24h分別代表熱脅迫處理1、1.5、3、6、12、24h后的葉片樣品；HR_1h、HR_1.5h、HR_3h、HR_6h、HR_12h、HR_24h分別代表熱脅迫處理1、1.5、3、6、12、24h后的根部樣品。圖7 ‘6421’辣椒LACS基因家族在不同非生物脅迫下的表達模式Fig.7 Expression patterns of LACS gene family from pepper ‘6421’ in different abiotic stress

2.6 不同鹽敏感品種中CaLACS基因家族對鹽脅迫響應的表達分析

為進一步驗證CaLACS基因在鹽脅迫處理下的表達情況，利用qPCR方法分析耐鹽自交系‘H1023’和鹽敏感自交系‘XWHJ-M’在3h和3d鹽脅迫處理下CaLACS基因的表達情況。結果(見圖8)表明，CaLACS1和CaLACS2基因在葉片中均顯著受NaCl誘導表達，耐鹽品種比鹽敏感品種的表達量更高，也表明CaLACS1和CaLACS2基因在NaCl脅迫中發揮重要的作用。

注：A_CK代表H1023噴施清水對照;A_3h代表H1023鹽處理3h;A_3d代表H1023鹽處理3d；B_CK代表XWHJ-M噴施清水對照;B_3h代表XWHJ-M鹽處理3h;B_3d代表XWHJ-M鹽處理3d。圖8 辣椒LACS基因家族在不同鹽耐受性品種中NaCl脅迫下的表達模式 Fig.8 Expression patterns of LACS gene family in pepperunder NaCl stress in different salt-tolerant cultivars

3 討論

與擬南芥和水稻等模式作物相比，辣椒中CaLACS家族中基因的相關研究還鮮有報道。本研究共鑒定出10個辣椒CaLACS家族成員，而在擬南芥[1]、甘藍型油菜[16]、蘋果[26]等作物中分別鑒定出9、34、11個LACSs基因，這可能是由于不同物種的基因組大小與基因復制方式不同，從而導致鑒定得到的LACSs成員數量不同。通過進化與基因結構等分析將LACSs 家族基因分為了8個亞家族，同一亞組內的CaLACS與擬南芥和水稻的外顯子數量基本一致，保守基序相同或相似，說明LACSs基因在進化上比較保守，同一亞組內的LACSs基因可能具有相似的功能[20-22]。

研究發現CaLACS基因啟動子區含有多個與激素響應和逆境脅迫相關的調控元件，表明CaLACS基因家族可能與非生物脅迫脅迫相關[27]。前人研究表明，與CaLACS1同一亞組的擬南芥AT3G05970為種子萌發和其他需要能量的生理過程提供能量[1]，公共數據庫的表達譜數據分析顯示，CaLACS1和CaLACS2在非生物脅迫下均具有較高的表達量，熒光定量數據也顯示，不同鹽耐受性品種在NaCl脅迫下，CaLACS1和CaLACS2基因均顯著受NaCl誘導表達，以上結果說明這2個基因可能與非生物脅迫響應關系密切。在后續的研究中，可以進一步驗證這2個基因在非生物脅迫中的功能。有研究表明，與CaLACS4同一亞組的擬南芥AT2G47240參與蠟的生物合成[12]，還是花粉被膜形成的關鍵基因[15]。對辣椒組織表達譜數據分析表明，基因CaLACS1和CaLACS4在花芽、果實、種子中均有較高的表達量，推測這2個基因可能與辣椒的生長發育相關，但其在脂類合成代謝中的作用尚不清楚，有待后續深入研究。

本研究利用生物信息學手段和公共數據在詳細分析辣椒CaLACS家族基因和初步解析其理化性質、亞細胞定位預測的基礎上，進行了辣椒LACSs進化、基因結構、保守基序及表達模式等分析，結合熒光定量PCR分析CaLACS基因家族在不同鹽耐受性品種中NaCl脅迫下的表達模式，挖掘鹽脅迫響應候選CaLACS基因。相關工作為明確CaLACS基因在非滲透脅迫和生長發育中的角色進行了初步的探索，并為今后進行CaLACS家族的基因克隆、功能驗證奠定了一定的基礎。