支氣管抽吸物中矮小同源盒2和Ras 相關結構域家族蛋白1A DNA 甲基化檢測對早期肺癌診斷價值的Meta分析△

張文川，趙佳寶，王哲，楊向紅

中國醫科大學附屬盛京醫院病理科，沈陽 110004

世界衛生組織（WHO）國際癌癥研究機構公布了2020年全球癌癥負擔的最新數據，乳腺癌是全球最常見的惡性腫瘤，肺癌位居第二位，但肺癌仍居男性惡性腫瘤首位[1]，包括小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中NSCLC占全部肺癌的80%，病理類型主要包括腺癌和鱗狀細胞癌等。由于缺乏靈敏度較高的診斷方法，早期肺癌的診斷準確度較低，導致患者確診時多已處于中晚期。目前，也仍然沒有特異性的肺癌篩查方法[2]，因此，迫切需要尋找更有效的早期肺癌篩查方法。

細胞學檢查是早期中心型肺癌的經典篩查方法[3]，是評估肺部病變良惡性的一種簡單、可靠、經濟、無創的方法；但由于痰細胞學檢查的靈敏度較低，肺癌篩查的成功率受到限制[4-5]。與其他侵入性手術相比，支氣管鏡檢查雖然也是一種微創技術，術后并發癥較少，但支氣管鏡檢查的診斷準確度也相對較差，靈敏度為30%～69%[6]。因此迫切需要一種創傷小、診斷能力強的方法。生物標志物在腫瘤的診斷中迅速發展，出現了一些有前景的候選分子，如DNA甲基化、補體片段、自身抗體、循環腫瘤DNA、微小RNA（microRNA，miRNA）及血液蛋白分析等，對肺癌的早期篩查具有重要意義。DNA甲基化是在DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化下，將甲基基團轉移到胞嘧啶堿基上的一種修飾方式，對基因表達的調控至關重要，DNA甲基化導致的表觀遺傳變化在多種腫瘤的發生發展中發揮著重要作用[7]。矮小同源盒2（short stature homeobox 2，SHOX2）和Ras相關結構域家族蛋白1A（Ras association domain family protein 1A，RASSF1A）的甲基化研究現處于第三階段，即用于篩查背景下風險管理（risk management in screening context，RMS）的后縱向研究階段，即將進入Ⅳ期臨床驗證水平[8]。有研究表明，SHOX2和RASSF1A的啟動子甲基化已被確定為肺癌診斷和預后評估的生物標志物[9]。因此，支氣管抽吸物比傳統血液檢測診斷肺癌的效能更佳且細胞濃度更高，本研究采用循證醫學的方法量化評價支氣管抽吸物中SHOX2和RASSF1A基因甲基化對早期肺癌的診斷價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 文獻檢索

計算機檢索 PubMed、Embase、The Cochrane Library、Web of Science、Clinical Trail、CNKI、萬方數據庫，檢索時間自建庫至2021年5月11日，檢索語種為英文和中文，檢索詞包括主題詞和自由詞。中文檢索詞為“肺癌”“SHOX2”“RASSF1A”；英文檢索詞為“lung neoplasms”“cancer of lung”“pulmonary neoplasms”“ras association(RalGDSAF-6)domain family 1 protein,human”“RASSF1A protein,human”“SHOT protein,human”“short stature homeobox 2 protein,human”。

1.2 文獻納入與排除標準

納入標準：①SHOX2或RASSF1A甲基化診斷肺癌的原始文獻；②以肺癌病理檢查為診斷金標準；③真陽性例數、假陽性例數、假陰性例數和真陰性例數可直接或間接根據文獻計算；④隊列或病例對照研究。排除標準：①動物實驗；②病例報道；③部分或全部文獻數據出現在另一篇文章中；④非中文和英文文獻；⑤會議摘要、綜述、薈萃分析。

1.3 文獻篩選和數據提取

由兩名研究員分別獨立篩選標題和摘要，并閱讀全文以確定合格的研究，如果存在爭議，則與第三名研究員協商一致解決分歧。研究資料包括：①作者、研究類型、國籍和年份；②甲基化陽性患者和陰性對照者；③SHOX2和RASSF1A甲基化的測定方法；④肺癌病理類型。對于數據不足的研究，向原作者發送郵件以獲取相關信息。

1.4 納入文獻偏倚風險評價

由兩名研究員獨立進行文獻偏倚風險評價，方法學質量評價采用診斷準確性研究質量評價工具2（quality assessment of diagnostic accuracy studies-2，QUADAS-2）[10]評估，通過RevMan 5.4軟件對每項研究進行質量評價。

1.5 統計學方法

采用Stata 16.0軟件進行Meta分析；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算曲線下面積（area under the curve，AUC），評估各指標診斷肺癌的靈敏度、特異度。通過Cochrane’s Q檢驗和Higgin I2評估各研究間的異質性，當I2≤50%或P＞0.10時，表明各研究間異質性較小，采用固定效應模型進行分析；當I2＞50%或P＜0.10時，表明各研究間的異質性較大，采用隨機效應模型進行分析。采用單一敏感性分析，通過移除一項研究（每次一項）來確定其是否對總體結果有重大影響。此外，還對樣本量、NSCLC占肺癌的比例和種族人群進行亞組分析以進一步探討異質性的來源。使用Deeks’漏斗圖驗證發表偏倚[11]。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 檢索結果

本研究初步篩選出6067篇文獻，通過查閱標題和摘要后篩選出27篇文獻，經過全文復篩，最終納入20篇文獻（中文文獻8篇[12-19]，英文文獻12篇[20-31]），共4238例患者，其中病例組2328例，對照組1910例。

2.2 納入文獻基本特征及質量評價

所有研究中，11項[12-22]在亞洲，8項[23-30]在歐洲，1項[31]在非洲，其中11項研究[12,14,16-17,19,22,25,28-31]中的2471例患者接受了SHOX2甲基化檢測，15項研究[12-20,22-27]中的3046例患者接受了RASSF1A甲基化檢測，5項研究[12,14,19,21-22]中的1469例患者同時接受了SHOX2和RASSF1A甲基化檢測。納入20篇文獻的基本情況見表1，采用QUADAS-2進行了質量評估，結果見圖1。

圖1 QUADAS-2評價文獻質量

表1 納入20篇文獻的基本情況

2.3 SHOX2甲基化、RASSF1A 甲基化單獨及聯合檢測對肺癌的診斷價值

SHOX2甲基化診斷肺癌的AUC為0.86，合并靈敏度為 0.73（95%CI：0.69～0.77），合并特異度為0.90（95%CI：0.86～0.93），陽性似然比和陰性似然比分別為7.50和0.30。RASSF1A甲基化診斷肺癌的AUC為0.82，合并靈敏度為0.51（95%CI：0.44～0.58），合并特異度為0.96（95%CI：0.93～0.98），陽性似然比、陰性似然比分別為14.10、0.50。SHOX2甲基化聯合RASSF1A甲基化診斷肺癌的AUC為0.90，合并靈敏度為 0.78（95%CI：0.73～0.82），合并特異度為0.87（95%CI：0.83～0.90），陽性似然比、陰性似然比分別為5.80、0.26。（圖2、圖3、圖4）

圖2 SHOX2甲基化診斷肺癌的森林圖

圖3 RASSF1A 甲基化診斷肺癌的森林圖

圖4 SHOX2和RASSF1A 甲基化聯合診斷肺癌的森林圖

分別依據樣本量、NSCLC占比、種族將SHOX2和RASSF1A甲基化對肺癌的診斷價值進行亞組分析。亞組1：樣本量＜200的亞組中，SHOX2和RASSF1A甲基化診斷肺癌的靈敏度分別為0.74和0.49，特異度分別為0.88和0.98；樣本量≥200的亞組中，SHOX2和RASSF1A甲基化診斷肺癌的靈敏度分別為0.72和0.53，特異度分別為0.91和0.96。亞組2：NSCLC占比＜80%的亞組中，SHOX2和RASSF1A甲基化診斷肺癌的靈敏度分別為0.75和0.49，特異度分別為0.88和0.97；NSCLC占比≥80%的亞組中，SHOX2和RASSF1A甲基化診斷肺癌的靈敏度分別為0.71和0.54，特異度分別為0.92和0.96。亞組3：亞洲人群的亞組中，SHOX2和RASSF1A甲基化診斷肺癌的靈敏度分別為0.73和0.57，特異度分別為0.89和0.93；在非亞洲人群亞組中，靈敏度分別為0.73和0.42，特異度分別為0.92和1.00。（表2）

表2 SHOX2和RASSF1A甲基化診斷肺癌的亞組分析結果

2.4 敏感性分析

每次對參與Meta分析的單個研究進行評估，以反映單個數據集對靈敏度和特異度的影響，結果顯示，該Meta分析不受單個研究的影響，I2統計量也表明沒有一項研究影響了該Meta分析的異質性。（表 3）

表3 SHOX2和RASSF1A甲基化診斷肺癌的敏感性分析

2.5 發表偏倚

本研究評估了這20項研究中SHOX2和RASSF1A甲基化的發表偏倚，結果顯示本研究無明顯發表偏倚。

3 討論

3號染色體短臂等位基因缺失是肺癌發病機制中最常見、最早的事件之一，超過90%的SCLC和50%～80%的NSCLC中均有發現[32-33]。RASSF1A基因位于3號染色體p21.3（3p21.3）帶，是肺癌最小純合缺失的120 kb區域[34]。此外，RASSF1A是一個常見的異常甲基化基因，在肺癌中，RASSF1A啟動子在NSCLC和SCLC中的高甲基化率分別超過50%和79%[35-36]。這與本研究結果接近，即RASSF1A在NSCLC占多數的肺癌樣本中的靈敏度為0.51。RASSF1A亦是RAS的負效應子，通常以其基因上4種主要的結構域包括C1結構域、RA結構域、共濟失調毛細血管擴張癥突變磷酸化位點和Salvador/RASSF/Hippo（SARAH）結構域，通過幾種不同的通路包括蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）/促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）等，在腫瘤中發揮腫瘤抑制因子的作用，包括細胞凋亡、基因組和微管穩定性及細胞周期調節。但RASSF1A高甲基化情況會發生反轉，肺癌中RASSF1A的缺失參與了肺癌分化程度的降低和干細胞特性的增強，是肺癌中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）耐藥、復發和轉移的必要條件。

SHOX2位于3號染色體（3q25.32）的長臂上，是同源盒家族成員。SHOX2編碼的DNA結構域由60個氨基酸組成。SHOX2是一種致癌基因，是細胞增殖和凋亡的調節因子和上皮-間充質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的誘導因子。SHOX2基因中有3個CpG島，而這些CpG島的甲基化可以深刻影響SHOX2基因本身及其他相關基因的表達。同時，SHOX2基因的CpG島經常被高甲基化，在腫瘤組織和細胞中高表達，如肺癌、乳腺癌、食管鱗狀細胞癌和肝細胞癌。在一些腫瘤中，SHOX2基因可通過參與調節成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）通路[包括RAS/ERK和磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）通路、干細胞多能性相關信號通路等]、EGFR-酪氨酸激酶抑制劑抗性及細胞增殖、遷移、分化和細胞表型，抑制細胞抗凋亡作用，還可通過增加RUNX2激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路并抑制p53活性，導致致癌生物學過程的發生。有趣的是，SHOX2能夠與轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）受體結合，并與NF-κB信號通路相互作用，與RASSF1A相互調控。因此，RASSF1A和SHOX2與Hippo、NF-κB和 TGF-β通路密切相關。有證據表明，RASSF1A和SHOX2的甲基化在肺癌的發生發展中是一個關鍵事件，是診斷肺癌的重要生物標志物，且對疑似肺癌患者的早期篩查非常有用[9,37]。目前研究顯示，表現出RASSF1A和SHOX2高甲基化的肺癌患者，組織學分化更差、臨床分期更晚、易局部復發，并明顯縮短了患者的總生存期和無病生存期，因此，甲基化檢測能為患者個性化治療選擇提供參考，對預測患者預后和監測疾病發生發展有重要的臨床意義。

血漿中SHOX2甲基化診斷肺癌的靈敏度為60.0%，血清或痰樣本中RASSF1A甲基化診斷肺癌的靈敏度和特異度僅為45%，診斷效能并不高，而本研究在支氣管抽吸物中發現，SHOX2和RASSF1A診斷肺癌的靈敏度和特異度均高于痰液或血液，這可能與樣本來源密切相關。支氣管抽吸物中肺泡腺上皮含量較多，檢測干擾少，標本質量較高。但在其他文獻中，結果還存在相當大的爭議。本研究對支氣管抽吸物中SHOX2和RASSF1A甲基化對早期肺癌的診斷價值進行Meta分析，結果顯示，SHOX2甲基化診斷肺癌的合并靈敏度和特異度分別為0.73和0.90，RASSF1A甲基化診斷肺癌的合并靈敏度和特異度分別為0.51和0.96，SHOX2和RASSF1A甲基化聯合診斷肺癌的合并靈敏度和特異度分別為0.78和0.87。雖然聯合診斷的特異度有所降低，但降低幅度很小并提高了整體靈敏度。本研究也有其不足和局限性，首先，由于本研究納入的文獻數量較少，可能無法全面評估SHOX2基因甲基化與肺癌間的真實關聯，并可能對本研究結果產生影響，有必要進一步擴大樣本量，以提供更具代表性的統計數據；作為回顧性研究，Meta分析可能存在選擇偏倚，可能影響研究結果。鑒于此，本研究結論尚需加大樣本量證實。

綜上所述，支氣管抽吸物中SHOX2和RASSF1A甲基化對肺癌的診斷價值較高，對CT檢查可疑肺癌的患者，是肺癌早期篩查的重要手段。對于疑似肺癌且支氣管鏡檢查未發現腫瘤的患者，進行支氣管抽吸物SHOX2和RASSF1A甲基化檢測對肺癌的早期診斷和預防具有重要意義。