植物組培苗生根研究綜述

龔永福，陳 芳，張兆萍，張梅秀，蘇毓杰，楊振華，魏廷邦，張英英，高正睿，魏玉杰*

(1.甘肅省農業工程技術研究院，甘肅武威 733006；2.甘肅省特種藥源植物種質創新與安全利用重點實驗室，甘肅武威 733006；3.國家中藥材產業技術體系河西綜合試驗站，甘肅武威 733006)

1902年，德國植物學家哈伯蘭特首次成功地將多種植物葉肉細胞分離并在人工培養基進行培養，提出植物細胞全能性理論，即離體植物細胞具有發育成完整植株的能力，為植物組織培養奠定了基本理論。近年來，組織培養技術得到快速發展，并廣泛應用于植物快繁脫毒、植物育種、遺傳工程及珍稀瀕危植物資源離體保存。然而，植物離體組織再生根是一個復雜的過程，在生根過程中存在著細胞脫分化難、對植物生長調節劑敏感性差、次生代謝物質抑制生長、污染率高等問題，導致部分植物組培苗生根率低、生根質量差或產生畸形苗，阻礙了一些生物技術在植物的應用，如基因編輯借助組織培養技術進行農桿菌介導的遺傳轉化，但獲得的遺傳轉化植株數量少、苗弱、生根困難、移栽難以成活，從而造成陽性材料的浪費。因此，植物組培苗提高生根率，獲得高質量的再生不定根已成為研究的熱點。研究表明，植物組培苗生根受外植體本身基因型、生理生化狀態、基礎培養基類型和生長調節劑的影響，還與碳源濃度、光照、光質等緊密相關。該研究從培養基(基本培養基類型、無機鹽濃度、碳源濃度和種類、凝固劑)、植物生長調節劑(IAA、IBA、NAA)、培養條件(暗培養時間、光源、光質、活性炭)、培養方式(兩步生根法、無糖組織培養生根法、瓶外生根法)進行歸納，分析影響植物組培苗生根的各方面因素，以期為今后實踐提供參考依據。

1 基本培養基對組培苗生根的影響

培養基分為基本培養基和完全培養基。基本培養基包括無機鹽、有機物、凝固劑、水等成分，為植物生長發育提供所需的各種養分。完全培養基在基本培養基的基礎上，根據試驗的不同目的，添加植物生長調節劑和其他有助于植物生長的物質。研究表明，基本培養基類型、無機鹽濃度、碳源種類和濃度、凝固劑均會對組培苗的生根產生影響。

在植物離體培養條件下，只有滿足組織細胞對營養的需求，才能更好地生長發育。科研人員對植物組培苗生根所需的基本培養基做了大量研究。不同植物組培苗誘導生根的基本培養基不同，羅漢果為B5培養基、西洋參為MS培養基、樟葉越橘為WPM培養基、鹿茸草為DCR培養基、杜梨組培苗為NN。同種植物不同基因型的基本培養基不同，西洋梨在MS培養基比QL更易于生根，梨矮化砧木S2、S5分別以1/2QL、1/2MS培養基為最佳。基本培養基不是一成不變的，為了獲得最佳的生根效果，通常需要根據植物自身營養需求，調整基本培養基的營養成分及含量。

無機鹽濃度對植物組培苗生根具有顯著影響。在組培苗誘導生根時，通常需要降低基本培養基中無機鹽濃度。韓如春等研究表明，1/2MS培養基比MS培養基更有利于植物組培苗生根。喻娜對1/4MS、1/2MS、MS、2MS培養基進行旱半夏組培苗生根研究時發現，1/2MS培養基生根率高、根粗壯、質量好，1/4MS培養基生雖然不定根數多，但根較細、出根時間慢，2MS培養基不定根數量少、根短粗，影響移栽后成活率。張琳娜等在不同無機鹽含量的培養基上誘導彌勒苣苔組培苗生根，發現1/2MS培養基生根率極顯著或顯著高于MS、1/4MS和1/10MS，且組培苗生長狀況最佳，根系發達。智邵川等、張春梅等、呂德任等分別在構樹、非洲菊、花葉艷山姜組培苗生根的研究中發現1/2MS培養基為生根最適培養基。通過大量研究表明，低濃度的無機鹽能促進植物組培苗生根，但濃度過低又會導致不定根比較細；高濃度的無機鹽則不利于生根且不定根質量差；對于大多數植物而言，組培苗生根最適培養基為1/2MS培養基。

植物組織細胞需要碳水化合物提高能量才能正常生長，在培養基中添加的碳源是糖類，常用的有蔗糖、葡萄糖、果糖等。糖類為組培苗提供能源外，還具有維持培養基滲透勢的作用，添加適量的糖是組培苗生根的關鍵。研究表明，不同植物組培苗生根所需的糖濃度不同，西洋參組培苗生根的最佳蔗糖濃度為30 g/L，花葉艷山姜、沙棗為20 g/L，天目杜鵑為5 g/L。史華平等對彩葉鳳梨組培苗生根研究發現，生根率隨著蔗糖濃度的升高呈現先增后減的趨勢。一般情況下，蔗糖濃度過低，不能滿足植物細胞營養、代謝的需要，濃度過高導致細胞滲透壓升高，抑制組培苗生根。呂德任等研究發現，不同種類的糖對花葉艷山姜組培苗生根誘導效果不同，含蔗糖的培養基誘導的根粗、長，明顯優于麥芽糖和乳糖的培養基。這是因為蔗糖降解產物為葡萄糖和果糖，極易被植物利用。石麗敏等研究發現，高濃度的蔗糖有利于生根壯苗和根數的增加。

凝固劑使組培苗在培養基上固定和生長，本身不提供任何營養成分。不同凝固劑的生根培養基組培苗生根效果不同。油菜組培苗生根采用加瓊脂粉的MS培養基時，地上部分生長健壯，但根細弱、生長慢。郝夢宇等將瓊脂粉換成瓊脂糖和植物凝膠后，生根質量顯著改善，其中植物凝膠生根效果最好。還有人在培養基中不加凝固劑，采用液體培養基誘導組培苗生根。劉曉迪等研究表明，液體培養能有效促進刺槐樹冠上部枝條生根，所得組培苗根長且根毛多。張雪君等對液體培養基和固體培養基進行比較，黨參組培苗在液體培養基的不定根生物量顯著增加，且組培苗生根培養時間由固體培養基的49 d縮短到24 d，培養周期大大縮短。這是因為液體培養基使外植體與培養基充分接觸，更有利于植物組培苗吸收營養和水分，間接提高了生根效果。以上研究表明，凝固劑對組培苗生根存在一定影響，植物組培苗生根時應根據生根情況選擇合適的凝固劑。

2 植物生長調節劑對組培苗生根的影響

植物生長調節劑是培養基中重要組成部分，與植物組織培養能否成功有直接關系。根據組織培養的目的，選擇不同的植物生長調節劑和濃度是關鍵。植物生長調節包括生長素、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸等。植物組培苗芽和根的分化主要受生長素和細胞分裂素比例的影響。研究表明，單獨使用生長素如IAA、IBA、NAA也能誘導生根。另外，同種植物不同品種生根對生長素需求不同。在草莓組培苗誘導生根中，隋珠品種在NAA濃度為0.1 mg/L時生根率為100%，生根質量最好；而紅顏品種不添加生長素，生根率就能達到100%且生根質量好。

生長素IAA(吲哚乙酸)在植物根原基形成過程中起著至關重要的作用，植物嫩芽產生的IAA通過向下極性運輸到基部誘導生根。外源添加IAA，也會對植物生根產生影響。趙東利等研究發現，大蒜根生長發育與IAA濃度有密切關系，生根率、平均根數隨著IAA濃度的增加呈現先上升后下降的趨勢。但IAA穩定性差，極易在培養基中氧化并被快速代謝。IBA(吲哚丁酸)比IAA穩定，可以外施IBA刺激植物嫩芽產生IAA，從而促進生根。目前，很多草本、木本植物組培苗采用IBA生根都取得了成功，如西洋參、纈草、青岡、油茶等。IBA和IAA也可以混合使用誘導組培苗生根。張延紅等研究表明，IBA在當歸組培苗根狀突起的誘導中起決定性作用，IAA促進根的進一步生長，IBA和IAA混合使用，誘導效果最佳。

NAA(萘乙酸)是人工合成的生長素，對不定芽的生根誘導有顯著影響，通過促進植物組織中儲存的淀粉分解為還原糖，為組培苗提供碳源，從而促進根的形成。組培苗根的生長發育同樣與NAA濃度密切相關。在一定范圍內，隨著NAA濃度增加，組培苗生根率、平均根數呈上升趨勢，但超過最佳NAA濃度就會抑制生根。在組培苗生根誘導中，NAA可以單獨使用，也可以和IAA、IBA混合使用。孫大寬等在木棉組培苗生根研究中發現，單獨使用NAA生根率最高為19.66%，單獨使用IBA為39.15%，生根率均較低，而將NAA和IBA混合使用時生根率到達了95.80%，效果顯著。

3 培養條件對組培苗生根的影響

培養條件對組培苗生根有顯著影響，特別是光在植物組培苗的生長和分化過程中具有主導作用，主要表現在暗培養時間、光源、光質等方面。

暗培養通過調控植物體內的激素代謝水平促進組培苗生根。植物離體組織生根先在黑暗條件下誘導然后轉入光照條件下培養是必要的。在木棉生根研究中，不進行暗培養時組培苗生根率為87.95%，暗培養6 d生根率達97.36%，生根率顯著提高。不同植物組培苗生根誘導的暗培養時間不同，彩葉鳳梨為7 d，樟葉越橘為15 d。但暗培養時間過長，又會造成組培苗無法進行光合作用而黃化。張炎研究發現，長時間暗培養會促進離體芽伸長，同時造成組培苗不可逆轉的玻璃化現象。因此，植物組培苗生根需要合適的暗培養時間。

不同光照條件，如光源、光質對組培苗生根有一定影響。羅劍飄等研究表明，不同光源對牛樟組培苗生根率及移栽后的成活率產生顯著影響，但對根長和根數無影響。LED和CCFL光源比普通熒光燈更利于組培苗生根，LED處理下非洲菊組培苗有機物累積量最高，有利于壯苗。不同植物組培苗生根對光質的需求不同，組合光更適用于組培苗的生長。周鵬等在烏飯樹組培苗生根研究中，與對照熒光燈相比，LED單色光處理下，藍光能夠顯著提高烏飯樹的生根率和生根數，紅光具有抑制作用。而楊艷敏等在藍莓組培苗生根研究中的試驗結果剛好相反，藍光處理組培苗生根率最低，紅光最高。王政等研究表明，以70%紅光+30%藍光的LED組合，紅葉石楠組培苗根數、根長、地上干物質等指標均優于其他處理，有助于組培苗的生長。

植物組培苗生根培養基中常加入活性炭。張春梅等研究表明，活性炭對非洲菊不定芽促進生根具有顯著作用，極大地縮短了生根時間。欒曉龍等在生根培養基中加入活性炭，秋子梨組培苗生根率、根數和根長均有提高。活性炭促進植物組培苗生根的原因可能是根的生長發育需要黑暗環境，活性炭使培養基變黑，恰好為根的生長提供了近似自然環境的黑暗條件，同時活性炭可以吸附培養基的有毒物質，抑制次生代謝物質的光氧化作用，為組培苗提供良好的生長環境，從而促進根的生長。不同植物組培苗生根需加入的活性炭濃度不一樣。鐵皮石斛活性炭最佳誘導生根濃度為0.5 g/L，秋子梨為1.0 g/L，非洲菊為 2.0 g/L。劉健暉等還對粗、細活性炭做了研究，試驗表明2種活性炭均促進了羅漢果組培苗生根，但效果不同，粗活性炭誘導的根更粗，細活性炭誘導的根更長，根盤更大。但也有植物組培苗生根培養基中加入活性炭并沒有促進生根，即使加入微量的活性炭，生根率反而降低了，如沉香、櫻花、毛菍等，可能原因是活性炭也會吸附培養基中的植物生長調節劑，降低了生根誘導效果。因此，活性炭具有兩面性，在生根培養基中需要加入適宜濃度的活性炭才能促進組培苗生根。

4 培養方式

植物根的形成分為2個階段，即根原基的誘導和分化，激素在根原基的誘導階段發揮著決定性作用；根分化階段激素不再是主要因素，濃度過高則會抑制根的生長。“兩步生根法”基于以上原理進行分步生根，即第1步是根誘導階段，在培養基中添加植物生長調節物質，在黑暗條件下培養一定時間，組培苗基部產生根原基；第2步是根伸長階段，將經過誘導的組培苗轉移到不含植物生長調節物質的相同培養基上，在光照條件下繼續培養。“兩步生根法”多用于較難生根的木本材料，如紫荊、石楠、櫻桃等。李艷敏等為解決紫葉加拿大紫荊組培苗生根率低、長勢弱的問題，通過“兩步生根法”，成功地使生根率達到了95.4%，根數7.71條，根長3.56 cm，效果顯著。同樣，趙亞楠等通過研究“兩步生根法”，篩選出了誘導不定根發生和促進不定根生長的最佳條件，解決了杜梨組培苗生根難的問題。

無糖組織培養是指在培養基中不添加糖等有機物，采用二氧化碳作為碳源、蛭石代替瓊脂粉進行植物組織培養，其大大降低了原材料成本，且組培苗污染率低，植株生長好等特點，在很多植物組織培養中得到應用。對歐梨、核桃組培苗生根進行無糖組織培養與常規組織培養比較，發現無糖組織培養植物生根率、移栽成活率更高，且根系發達，植株健壯，整體效果好。王立等的研究進一步表明無糖組織培養比傳統組織培養有更高的SOD、CAT和POD活性，使組培苗移栽后有較強的逆境脅迫反應能力。

瓶外生根有基質培、水培、氣培，大多采用基質培，即將組培苗以微型插穗的方式扦插在無菌基質上進行生根。該方法與馴化相結合，簡化了組織培養步驟，具有培養時間短、成本低、移栽成活率高等優點，可以進行植物大規模擴繁。基質是植物瓶外生根的關鍵因素，因不同基質透氣性和保水性不同，基質組合、配比對生根率、根數、幼苗生長影響較大。任俞新在款冬瓶外生根研究中表明，當基質以黃綿河沙∶蛭石=2∶1時，組培苗生根率高，生根數多，幼苗生長健壯，當僅為蛭石時，組培苗生根效果較差，不及前者。另外，組培苗瓶外生根還受練苗時間、外部環境條件的影響。趙春莉等研究認為，影響瓶外生根率高低的因素為：扦插基質>練苗時間>空氣濕度。

5 結論與討論

植物組織培養技術不斷發展，在花卉、中藥材、樹木等取得了一定成果，一些植物已建立了組織培養體系。但不同植物組培苗不定根再生難易程度存在差異，遺傳轉化植株不定根再生成為現代生物技術能否成功應用于植物的限制因素之一。提高植物組培苗生根率和生根質量，應從基本培養基、植物生長調節劑、培養條件、培養方式著手。就生根培養基而言，不同植物組培苗生根所需的基本培養基不同，同種植物不同基因型生根培養基也不同，低濃度的無機鹽能促進組培苗不定根再生，1/2MS培養基能滿足絕大多數植物組培苗生根，碳源濃度和種類、凝固劑也會對組培苗生根產生影響，在選擇生根培養基時應充分考慮以上因素的影響；植物生長調節劑對組培苗生根具有決定性作用，濃度過高、過低都不利于生根，篩選適宜濃度的外源激素是生根的關鍵；通常誘導植物組培苗生根的外源激素為IAA、IBA、NAA，但IAA穩定性差，常用IBA代替IAA使用，IBA和NAA混合使用生根效果更佳。另外，同種植物不同品種、無性系對植物生長調節劑濃度變化的敏感度存在差異，在越南奇楠沉香組培苗生根研究中，不同無性系對NAA濃度變化敏感度差異較大，說明基因型在生根誘導中的影響不可忽視。光對植物形態建成有調控作用，在根原基誘導階段適當的暗培養是必要的，LED光源生根質量優于普通熒光燈，紅、藍組合光有助于植物生長；大部分生根培養基加入適宜濃度的活性炭，組培苗生根效果更好，且生根時間大大縮短。各因素對植物生根的影響程度也不同，羅漢果組培苗生根各因素影響程度從大到小依次為：培養基、活性炭、NAA、蔗糖。兩步生根法根據組培苗生根不同階段對光、植物生長調節劑的需求細化了組織培養步驟，為組培苗生根提供了更加適宜的生長環境；無糖組織培養生根法是一種新型的組織培養方式，根據植物生長情況，通過人工控制動態調整CO濃度、溫度、光照等進行植物生長環境的優化，使其處于最佳狀態，大幅度減少了污染率，并提高了組培苗生根率、植株質量和移栽生活率，以上2種生根方式是對常規組培方法的改進，克服了常規組織培養的缺陷，很好地解決了遺傳轉化植株因生根問題造成的材料浪費，促進了生物技術的應用。無糖組織培養技術出現較晚，在國內并沒有廣泛應用，隨著技術不斷發展和設備的完善，今后將會成為一種重要的組培手段。瓶外生根法將組培苗生根和馴化相結合，進一步簡化了植物組織培養流程，節省了成本和時間，并提高了組培苗移栽成活率，可以進行花卉、中藥材等植物的大規模擴繁，從而滿足市場的需求。