枸杞多酚氧化酶研究進展

張 琪，劉軍紅

(寧夏大學新華學院，寧夏銀川 750000)

枸杞(L.)是傳統的中藥和保健食品，富含類胡蘿卜素、氨基酸、V、多酚、多糖、礦物質等有效成分，具有滋養肝腎、降血糖、降低癌癥和延緩細胞衰老、提高免疫力等藥理功效。枸杞在采摘、貯藏過程中很容易發生褐變。鮮果枸杞果皮較薄，果實汁液較多，采摘、貯存、運輸過程中都極易造成機械損傷，這為枸杞酶促褐變和微生物的侵入創造了有利條件，采后如不及時采取保鮮措施，很快就會發生酶促褐變。目前，枸杞主要以干制、酒類、飲料等產品形式出售，但在干制、榨汁過程中極易造成多糖、維生素、氨基酸等營養成分的損失，在一定程度上降低了枸杞的功效，且干果枸杞在加工及貯藏過程中也會發生褐變，影響品質。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是催化酚類底物氧化的一組金屬蛋白酶，廣泛存在于多種植物中。PPO是引起枸杞酶促褐變的主要酶類，能夠催化底物生成褐色的醌類物質，參與果蔬的酶促褐變反應過程。枸杞貯藏過程鮮果保質期短、干果營養損失大的問題是目前枸杞資源開發利用的瓶頸，如何抑制PPO酶促褐變是解決枸杞鮮果貯藏的關鍵點。目前所采用的方法主要有物理法、化學抑制劑法、生物源保鮮法等，該研究簡要梳理近年報道的枸杞多酚氧化酶相關研究，以期為枸杞酶促褐變基礎研究與應用研究提供參考依據。

1 PPO的存在形式及褐變機理

在大多數果蔬中，PPO主要以結合態存在，且多少隨果蔬的成熟度的變化而改變。PPO是嚴格的質體酶，主要分布在完整細胞的有色體、葉綠體和白色體等質體中，底物分布在液泡中，正常情況下兩者分離，當果蔬細胞膜結構完整性遭到破壞，分屬不同組織區域的PPO與酚類接觸，在氧氣的作用下催化酚類產生醌，醌自發聚合并與蛋白質的氨基酸殘基側鏈基團反應產生黑色或褐色物質，從而發生酶促褐變。枸杞果中含有咖啡酸丁二酯、二咖啡酰奎寧酸、綠原酸等12中酚類物質，其中綠原酸的含量最高。綠原酸是枸杞酶促褐變的主要底物之一，是導致枸杞酶促褐變的主要原因。

2 PPO的分子結構

PPO的分子質量范圍31～144 kD，且不同成熟期分子質量不同。目前已知的PPO是四聚體蛋白酶，這種四聚體結構依賴于所處的環境，當環境發生改變，這種四聚體會發生解離，因此，植物中的PPO通常以不同的分子形式存在。PPO是核編碼的氧化還原酶，其活性中心含有以Cu—Cu離子對形式緊密結合在一起的2個銅離子。圍繞2個銅離子形成了由3個組氨酸和1個半胱氨酸形成的CuA區域和由3或4個組氨酸形成的CuB區域，銅離子和硫通過共價鍵形成特殊的二硫銅復合物。PPO是在胞質中合成的，在運往質體前還包含一個富含His的8～12 kD的信號肽。

3 不同抑制方法對枸杞中PPO活性的影響

物理法主要是通過溫度、pH、氣體成分、壓力等物理參數的改變延緩酶促褐變的發生。

溫度。溫度對PPO的活性有較大影響，高溫和低溫對PPO的活性都有抑制作用，其影響程度因果蔬的品種、部位而有所不同。枸杞PPO的最適溫度為36 ℃左右，不同品種的枸杞最適溫度略有差異。

研究證實，低溫能顯著抑制PPO的活性，緩解酶促褐變的發生。葛向珍等研究對比了低溫和常溫對去梗大果枸杞保鮮的影響，結果表明，低溫貯藏可以有效維持果實品質。低溫貯藏的溫度控制在0 ℃與生物冰點溫度之間能更好地減少果實內部水分的損失、降低酶活性，進而保證果實的理化指標、減少營養物質的損失、延長枸杞的貯存期。低溫貯存條件下除了抑制PPO的活性，果實也能維持較高的活性氧清除能力、較好地保持細胞膜的完整性，從而抑制枸杞果實褐變的發生。同時低溫也會影響非酶促褐變的發生，抑制微生物的大量繁殖，抑制枸杞呼吸強度、果膠酶活性，減緩可滴定酸含量、過氧化物酶活性的下降和V含量的損失等，對保護枸杞果實的品質有一定積極作用。

PPO并不是耐熱性的酶，因此通過高溫短時熱處理，可使其部分或全部不可逆地失活，從而抑制酶促褐變的發生。研究證實，70 ℃以上高溫處理可以有效抑制枸杞鮮果中PPO的活性，且溫度越高，完全抑制酶活性所用的時間越短。但過高溫度處理又會加快V等營養成分的破壞，因此，枸杞PPO的抑制宜采用高溫短時的熱處理方式。朱金霞等綜合考慮營養成分等情況，推薦80 ℃熱處理3 min抑制枸杞酶促褐變。從加熱方式上，微波加熱及聲熱處理技術相較于傳統的熱傳導、熱對流及熱輻射滅酶效果要好。

pH。當pH 3.0～8.0時，枸杞PPO的相對酶活性呈現雙峰型曲線。據此推斷枸杞中PPO可能具有同工酶或多種分子形式，劉威報道鮮果枸杞中PPO的最適pH為4.5，第2最適pH為7.0，且在酸性條件下活性相對較高。也有報道認為，第2最適pH是因為PPO是一種含銅的蛋白質，其中的銅離子在不同的pH條件下有不同的解離度，從而出現雙峰型曲線。pH對PPO的影響在于改變酶表面的電荷影響其溶解度以及破壞其空間結構。當pH較低時，酶中的銅離子會被解離出來，使酶失活；當pH較高時，銅離子則與酶蛋白脫離，生成Cu(OH)，使酶失活。

其他物理方法。除了傳統的溫度、pH外，近年來，也有一些其他物理方法應用到枸杞PPO的抑制研究中。超高壓通過改變生物體內大分子中的非共價鍵結構，能一定程度上鈍化某些酶類的活性，但枸杞中的PPO普遍都有較強的耐壓性。研究表明，枸杞鮮果在壓力325.77 MPa、溫度28.74 ℃條件下保持10.43 min，微生物殘存數量可以達到國家安全食品最低標準，對PPO的活性影響不顯著。黑果枸杞在300 MPa壓力下PPO的活性并沒有降低，而400 MPa以上高壓才能使PPO活性降低至0.5 U/mL。600 MPa保壓15 min，枸杞中的PPO仍然能保持一定的活性。高壓處理相對于殺滅微生物，引起枸杞褐變的主要酶類都具有較高的耐壓能力。僅靠高壓處理來徹底鈍化PPO，防止酶促褐變的效果不是很明顯，需結合其他手段(如溫度)來控制PPO活性。

氣調貯藏可以通過有效地降低果蔬的呼吸作用、蒸發作用和抑制微生物生長，使得貯藏中的果蔬產品處于近類于休眠狀態，讓其正常的生理活動降低至最低程度。Selcuk等在0 ℃下評價了主動氣調對枸杞鮮果的保鮮效果，發現2%O+5%CO可以抑制PPO的活性。

化學試劑不僅影響PPO的活性，同時也會影響PPO的構象。不同的化學試劑對于PPO的二級結構、三級結構的影響效果有著明顯差別。根據抑制劑對酶促反應抑制的方式，PPO抑制劑主要有金屬螯合劑、競爭性抑制劑、與氧化產物醌作用的還原劑、醌偶合劑、與酚類底物作用的化合物等。

金屬螯合劑。CaCl中的Ca可與PPO中的Cu競爭，抑制PPO的活性。此外Ca還可與氨基酸反應形成非水溶性化合物，從而減少非酶褐變的發生。通過研究2個品種的枸杞酶學特性，發現當溶液濃度1.2 mol/L時，枸杞PPO相對酶活性均降至10%以下，且相對酶活性均隨溶液濃度的增加而顯著降低，抑制效果明顯。因此，CaCl可作為枸杞鮮果PPO活性的優良抑制劑。CaCl結合其他抑制因素對枸杞PPO活性的抑制效果有待進一步研究。

競爭性抑制劑。芳香族羧酸是PPO很好的抑制劑，對酶類底物芳香族羧酸起競爭性抑制作用。水楊酸是一種簡單的酚類化合物，被認為是一種新的植物內源激素，參與植物生長發育、成熟衰老等多方面的生理調控。適量濃度的水楊酸處理能顯著降低果蔬PPO的活性，從而起到延緩果實褐變的作用。研究表明，1.0 mmol/L水楊酸處理能顯著降低PPO的活性。此外，不同濃度的水楊酸浸泡處理能顯著降低枸杞鮮果的腐爛率，延緩V的下降，提高過氧化氫酶(CAT)的活性，降低PPO的活性，減緩細胞膜的損傷，延緩果實衰老，延長鮮果貯存期。對其他果蔬的研究表明，水楊酸處理結合其他化學保鮮劑或者其他物理保鮮法效果更好，但復合處理對枸杞的處理效果目前沒有報道。

還原劑。該類化合物能夠和酚類的氧化產物醌作用，使醌還原為原來的底物，從而防止醌繼續反應生成有色物質，從而抑制酶促褐變的發生。

抗壞血酸既是有機酸，又是還原劑。它既可以作為醌的還原劑，將氧化的醌還原為酚類物質，阻止醌類物質進一步自發聚合形成色素物質，又可以作為酶分子中銅離子的螯合劑，降低PPO的活性，它甚至可以被PPO直接氧化，這樣又可以起到競爭性抑制劑的作用。同時，抗壞血酸能降低環境的pH，抑制酶活性。抗壞血酸對酶促褐變的抑制效果取決它的濃度。朱金霞等研究發現，紅果枸杞和黃果枸杞鮮果的PPO活性均隨抗壞血酸溶液濃度的升高而降低，濃度為88.0 mmol/L可完全抑制黃果枸杞PPO相對酶活性。

與氧化產物醌作用的還原劑除抗壞血酸外，還有二氧化硫、亞硫酸鹽、巰基乙酸鹽等，但有些不宜用做食品添加，因此限制其在枸杞中的使用。

醌耦合劑。這類化合物能夠和醌作用，生成穩定的無色化合物，防止第二步酶促反應的繼續發生。同時，這類化合物還能導致蛋白酶含量的增加，從而分解PPO，也能起到防止褐變的作用。

L-半胱氨酸是一種天然含硫氨基酸，可與酶促反應產物——醌類物質結合生成硫氫化合物，從而抑制酶促褐變。研究表明，L-半胱氨酸在較低濃度時就能較好地抑制鮮果枸杞PPO的活性，0.024 mmol/L時可完全抑制PPO的活性，可以作為首選抑制劑。

天然抑制劑具有安全、無毒、無殘留的優勢。具有PPO抑制作用的天然抑制劑主要有黃酮類、醛類、糖苷類、苯丙素類及真菌代謝物類，這些提取物中的抗氧化物可以保護枸杞中的酚類物質不被氧化。趙榮祥等研究了花椒、藿香、荷葉、丁香、丹參等18種植物提取物對PPO的抑制效果，結果表明，18種提取物均對鮮果枸杞的PPO活性有一定的抑制效果，其中以荷葉乙醇提取物和檸檬油提取物的抑制效果最為明顯。

植物生長調節劑通過抑制PPO酶的活性或抑制抗壞血酸的下降及調節乙烯含量從而達到抑制酶促褐變的作用。

1-甲基環丙烯(1-MCP)能與乙烯受體結合，阻斷乙烯信號傳導，能較好地保持果實的完整性。赤霉素可降低PPO的生物合成以減少采后褐變。適當濃度的ClO可以阻止蛋氨酸分解為乙烯，且破壞已經形成的乙烯，抑制果實的衰老，對延緩枸杞鮮果的衰老有一定作用。ClO也能抑制V氧化酶的活性，減少V的損失。NO通過影響植物內部乙烯合成和內部NO代謝延緩果蔬衰老進程。NO能抑制細胞色素C氧化酶活性、線粒體呼吸鏈上復合體Ⅰ和復合體Ⅱ，與氧可逆性競爭而抑制呼吸鏈，導致線粒體產能過程受阻，從而抑制呼吸作用，延遲呼吸高峰的出現。NO熏蒸處理枸杞鮮果可顯著降低枸杞鮮果呼吸速率和果實腐爛率。NO處理能顯著抑制貯藏期枸杞PPO活性，有效降低果實的褐變度。同時，NO熏蒸可顯著抑制果實中抗壞血酸含量下降。

4 其他方法

酶促褐變的發生需要3個條件：底物(多酚類物質)、氧介質、PPO。除了采用物理或化學方法抑制PPO活性外，隔絕空氣也可以延緩酶促褐變的發生。

玉米醇溶蛋白是一種從玉米蛋白粉中提取的天然高分子材料，具有良好的成膜性，將玉米醇溶蛋白與80%的乙醇溶液1∶10涂抹于鮮果枸杞表面，可以抑制氣體交換，降低呼吸速率，減少水分蒸發，防止微生物的大量生長，更好地保持營養成分和色澤。

殼聚糖是一種源自甲殼類動物的外殼及菌類、藻類的陽離子高分子多糖，噴涂于果實表面可形成一層透明的無色薄膜。該膜具有通透性、阻水性，對CO、CH和O有選擇透過性，可延長果蔬貯藏保鮮時間。殼聚糖涂膜于鮮果枸杞，可一定程度抑制枸杞鮮果的腐爛和失水萎蔫，減緩V、可溶性固形物和可滴定酸含量的降低，保持果實良好的商品品質，延長保鮮期，其中以1.25%殼聚糖涂膜處理的枸杞鮮果的保鮮效果最佳。單一涂抹往往不能發揮最佳的保鮮效果，殼聚糖-山梨酸鉀復合涂抹保鮮效果更好。

5 展望

不同抑制劑的抑制機理各不相同，相對而言，復合處理效果更好。如采用不同溫度結合不同充氣包裝、殼聚糖結合山梨酸鉀涂膜保存、1-MCP結合氣調包裝和以NO浸泡處理等復合處理效果均好于單獨處理。

PPO的作用會導致枸杞的褐變，影響枸杞的品質。長期以來，枸杞的酶促褐變一直是影響枸杞產業發展的重要制約因素。隨著人們對枸杞鮮果的需求不斷增加，有關枸杞PPO引起的褐變也逐漸受到重視，未來有關枸杞PPO的酶學特性和影響因子的研究也將更加深入。