苗藥黑骨藤種子育苗萌發因素篩選及優化

龍金蘭 吳之坤

貴州中醫藥大學，貴陽 花溪 550025

黑骨藤(PeriplocaforrestiiSchltr.)為蘿藦科(Asclepiadaceae)杠柳屬(Periploca)植物，植物名為黑龍骨[1]，藥材名為黑骨藤[2]。該植物多生長于海拔2000 m以下的山地疏林向陽處、陰濕的雜木林下或灌木叢中[1]，一般纏繞在周邊喬木、灌木或者高大的草本植物上。目前，以黑骨藤為主要原料的藥物黑骨藤追風活絡膠囊已研發并投入市場，在治療風寒濕痹、腰腿疼痛等疾病方面有很好的療效。隨著野生資源的大量使用，導致黑骨藤野生資源面臨匱乏的危機，因此開展黑骨藤野生變家種的研究工作顯得尤為緊迫。近年來有關黑骨藤的研究主要集中在化學成分、藥理作用、質量控制及評價等方面，而在其繁育方面未做詳細的研究。黑骨藤為多年生的藤本植物，其主要繁殖方式為有性繁殖，但有關其種子生物學方面的研究未見報道。本研究針對黑骨藤的種子進行萌發試驗，考察種子萌發消毒條件、萌發基質、溫度和光照等不同萌發因素的影響，篩選及優化黑骨藤萌發的最佳條件，以期為黑骨藤的野生變家種及可持續開發利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 黑骨藤成熟種子采集于貴陽市烏當區香紙溝(H 1017.61 m；N 26°46′26.90″；E 106°55′12.16″)，果實采集后放置于自然通風處及時晾干，人工剝出種子，去除種毛及雜質，選取顆粒飽滿的種子，放置于4 ℃的短期種子庫中保存，為后續實驗做好準備。實驗所用材料經貴州中醫藥大學鑒定教研室主任吳之坤副教授鑒定為蘿藦科杠柳屬植物黑骨藤(Periplocaforrestii)的種子，其憑證標本(憑證標本號：HGT201129002)存放于貴州中醫藥大學中藥材種植(養殖)及加工研究所。

1.2 儀器與試劑 儀器：RQX-400B、RQX-400G、RQX-300型人工智能培養箱(常州市華普達教學儀器有限公司)、AUW120D型十萬分之一天平[島津儀器(蘇州)有限公司]、游標卡尺、XTZ-E型體式顯微鏡(上海光學儀器一廠)、Paola2053型解剖刀、BOXUN型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)、培養皿(直徑15 cm)、鑷子、燒杯、紗布、濾紙(15 cm)、脫脂棉、河沙等實驗室常用儀器設備及耗材。試劑：75%乙醇、0.1%高錳酸鉀和5%次氯酸鈉分別以批號為20201214無水乙醇(天津市鑫鉑特化工有限公司)、20210103高錳酸鉀(重慶川江化學試劑廠)、20210523次氯酸鈉(天津市北辰方正試劑廠)與滅菌水配置而成。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子消毒條件的選擇 取黑骨藤種子，用蒸餾水沖洗種子表面污物，用濾紙吸干，再用干凈的紗布包好放置備用。隨機選取洗凈且飽滿的黑骨藤種子，用不同消毒方法[3](0.1%高錳酸鉀、5%次氯酸鈉、75%乙醇)分別對黑骨藤種子進行表面消毒后，放置在鋪有濕潤濾紙的培養皿中，置于人工智能培養箱中進行萌發實驗，重復3次，每次重復30粒種子，觀察種子霉爛及萌發情況并記錄，從而選擇最佳的消毒處理方法。

1.3.2 萌發基質的選擇 用5%次氯酸鈉消毒后的黑骨藤種子置于鋪有潤濕的紗布、濾紙、脫脂棉和河沙4種不同基質的培養基中，放在已設置溫度、光照等的智能人工氣候箱中培養，每個萌發基質平行操作3組，每組30粒，觀察各基質種子的萌發情況并如實記錄每日種子萌發數，選擇最適宜的萌發基質。

1.3.3 光照條件的選擇 在消毒條件、基質、溫度等萌發條件一定的條件下，對黑骨藤的種子進行全黑暗、光照10 h/14 h、光照12 h/12 h、光照16 h/8 h和全光照5種光照處理，將已消毒的種子放入有潤濕基質的培養皿中，置于智能培養箱內觀察不同光照處理對黑骨藤種子萌發的影響，每種處理3組平行操作，每組30粒，觀察各處理種子的萌發情況并如實記錄每日種子萌發數，以此對光照條件進行選擇。

1.3.4 萌發溫度的選擇 在消毒條件、基質、光照等一定的條件下，將已消毒的黑骨藤種子放入已潤濕基質的培養皿中，分別置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃ 4個溫度的培養箱內培養，觀察各溫度條件下種子的萌發狀況，每種溫度重復3次，每次重復30粒種子。

注：萌發標準為胚根突破種皮1 mm以上，萌發結束標準以連續3～5 d萌發數值不再增加即停止實驗，記錄數據并且計算發芽勢和萌發率等。

1.4 指標測定 發芽勢(S，%)=n/N×100%，式中：n為發芽高峰期發芽的種子數，N為供試種子總數；

萌發率(F，%)=Z/N×100%，式中：Z為試驗結束后萌發種子的總粒數，N為供試種子總數；

發芽指數[4-5]=ΣGt/Dt，式中：Gt為在時間t天發芽的種子數，Dt為相應的發芽天數；

萌發時滯[6]：從萌發試驗開始到第 1 粒種子開始萌發所需要的天數；

萌發歷期[6]：從萌發試驗開始到結束萌發需要的天數。(結束萌發以萌發數不再增加的第1天為計)。

1.5 數據處理試驗 數據采用 Microsoft Excel 軟件進行統計，用SPSS 23 軟件進行單因素方差分析，比較不同處理之間的差異性。

2 結果與分析

2.1 不同消毒條件對黑骨藤種子萌發特性的影響 通過采用不同消毒條件對其進行處理，萌發結束后統計各項萌發指標及分析(表1)，發現以5%次氯酸鈉進行種子消毒處理的發芽勢最高，高達60%以上，顯著高于采用0.1%高錳酸鉀處理(P<0.05)，極顯著高于采用75%乙醇處理(P<0.01)。并且該條件下，種子萌發率最高(97.78%)，比0.1%高錳酸鉀、75%乙醇處理的分別高出3.34%、91.11%；采用0.1%高錳酸鉀處理比75%乙醇處理的高出77.77%。75%乙醇與5%次氯酸鈉、0.1%高錳酸鉀之間的萌發率都具有極顯著的差異性(P<0.01)。

黑骨藤種子在萌發過程中，會出現霉爛的情況，通過統計其結果(表1)，可知采用0.1%高錳酸鉀處理的發霉率最低，而75%乙醇處理的發霉率最高，比0.1%高錳酸鉀、5%次氯酸鈉處理的分別高出5.56%、4.45%。

發芽指數能體現出種子的活力潛能[6]，通過統計其結果并分析，在不同消毒處理下，可知采用5%次氯酸鈉處理的發芽指數最大，比0.1%高錳酸鉀、75%乙醇處理的分別高出6.61%、24.4%。5%次氯酸鈉與75%乙醇之間的黑骨藤種子的發芽指數差異性極顯著(P<0.01)。由此可見，采用5%次氯酸鈉處理對種子的活力促進作用最好。

通過統計其結果(表1)，可知采用0.1%高錳酸鉀處理的萌發時滯最短，比5%次氯酸鈉、75%乙醇處理的萌發時滯分別縮短2.34 d、7.34 d，且5%次氯酸鈉、0.1%高錳酸鉀與75%乙醇處理的黑骨藤種子之間的萌發時滯有極顯著差異(P<0.01)。采用5%次氯酸鈉處理的萌發歷期最短，比0.1%高錳酸鉀、75%乙醇處理的萌發歷期分別縮短5 d、4 d。

綜上分析，5%次氯酸鈉消毒效果更好且能明顯促進種子萌發，故選擇5%次氯酸鈉作為黑骨藤種子萌發的最佳消毒條件。

表1 不同消毒條件對黑骨藤種子萌發特性的影響

2.2 不同萌發基質對黑骨藤種子萌發特性的影響 由表2可知，以河沙為萌發床的發芽勢最高，為53.33%，但其發霉率最高，高達6%以上，發芽指數最低(27.73)，說明以河沙作為萌發床對萌發的促進作用不大；其次是濾紙，為50.00%，其發芽指數最高(30.41)，對種子的萌發有明顯的促進作用；紗布發芽勢最低，為42.22%。不同萌發基質間的萌發率，以脫脂棉和濾紙為萌發床的種子萌發率最高，均達92%以上，紗布的萌發率最低(87.78%)。

從萌發時滯和萌發歷期的角度分析，濾紙和脫脂棉兩種萌發基質的萌發時滯最長，均為5.33 d，紗布的萌發時滯最短，為4.33 d；濾紙和脫脂棉的萌發歷期最短，均在17 d左右，而紗布的萌發歷期最長，達20 d以上。經多重比較分析，4種萌發基質之間的萌發率、發霉率、發芽指數、萌發時滯和萌發歷期均不具有顯著差異(P>0.05)，而河沙與脫脂棉、紗布之間的發芽勢和發霉率之間具有顯著差異(P<0.05)。

綜合分析：脫脂棉和濾紙在萌發率、萌發時滯和萌發歷期上無顯著差異，從發霉率和萌發效果上比較，脫脂棉較濾紙發霉率低，且種子萌發效果好，苗的根系發達，莖粗壯，故而選擇脫脂棉作為黑骨藤種子的萌發床。

表2 不同萌發基質對黑骨藤萌發特性的影響

2.3 不同光照條件對黑骨藤種子萌發特性的影響

2.3.1 不同光照條件對黑骨藤種子發芽勢、萌發率及發霉率的影響 由圖1 A可知，在不同光照條件處理下，隨著光照時間的增加，黑骨藤種子的發芽勢、萌發率和發霉率均呈先下降后升高又下降的變化趨勢。全黑暗的發芽勢和萌發率均最高，分別為73.33%、96.67%。其發芽勢與光照10 h、光照12 h、光照16 h、全光照4種光照條件處理的發芽勢相比分別上升了58.89%、27.77%、13.33%、24.44%；萌發率與光照10 h、光照12 h、光照16 h、全光照相比分別上升了2.23%、7.78%、1.11%、5.56%；且除全光照與光照12 h之間的發芽勢無顯著性差異外(P>0.05)，其余兩兩比較均具有極顯著差異(P<0.01)，不同光照處理間萌發率差異均未達顯著水平。光照10 h處理的發霉率為零，與全黑暗、光照12 h、光照16 h、全光照相比分別降低了1.11%、11.1%、6.67%、3.33%，且各處理間發霉率均無顯著差異(P>0.05)。由此可見，光照會對黑骨藤種子前期的萌發有抑制作用，也可能誘發種子的霉爛；但適宜光照時間能促進黑骨藤種子的萌發，對種子的萌發芽的長勢有促進作用。

通過觀察發現，全黑暗處理的幼苗須根較多，主根較弱，幼苗植株根莖細且長，光照條件下幼苗矮壯，根莖較粗。對不同程度的光照時間進行了篩選，發現光照時間為 16 h 時，種子的萌發較快且幼苗粗壯。

2.3.2 不同光照條件對黑骨藤種子發芽指數的影響 由圖1 B可知，在不同光照條件處理下，全黑暗的發芽指數最高(38.73)；其次是光照12 h(27.55)、全光照(27.92)、光照16 h(27.17)，光照10 h的發芽指數最低，為22.35。通過兩兩比較結果分析，全黑暗與光照10 h、光照12 h、光照16 h和全光照的發芽指數之間具有極顯著差異外(P<0.01)，其余4種光照條件處理的黑骨藤種子發芽指數均無顯著性差異(P>0.05)。由此可見，光照對種子對黑骨藤的種子活力有一定的抑制作用。

2.3.3 不同光照條件對黑骨藤種子萌發時滯和萌發歷期的影響 由圖1 C可知，在不同光照條件處理下，全黑暗處理的黑骨藤種子萌發時滯最短(2 d)，與光照10 h、光照12 h、光照16 h和全光照處理的黑骨種子萌發時滯差異顯著(P<0.01)；其次是光照10 h處理的，萌發時滯為4.33 d，與全黑暗相比延長了2.33 d，而與全光照、光照12 h和光照16 h處理，黑骨藤種子萌發時滯分別縮短 1 d、0.67 d、2 d，且5種光照條件處理的萌發時滯之間均無顯著性差異(P>0.05)。

全黑暗處理的黑骨藤種子萌發歷期最短(18.33 d)，與光照10 h和光照16 h、光照12 h、全光照相比分別縮短了5 d、4 d、3.67 d；光照 10 h、光照16 h處理的黑骨藤種子萌發歷期最長，均為23.33 d，且5種光照條件處理的萌發歷期之間均不具有顯著性差異(P>0.05)。

綜合結論：雖然全黑暗處理下黑骨藤種子的發芽勢、萌發率、發芽指數很高，萌發時滯和萌發歷期短，苗長勢高，但苗的根及莖干均不夠發達、不夠粗壯，苗較脆弱；通過綜合分析，在有光照的條件下，選擇發芽勢、萌發率高，發霉率低且幼苗粗壯健康，光照16 h處理作為黑骨藤種子萌發的最適宜光照條件。

圖1 不同光照處理對黑骨藤種子萌發特性的影響圖

2.4 不同溫度處理對黑骨藤種子萌發特性的影響

2.4.1 不同溫度處理對黑骨藤種子發芽勢、萌發率及發霉率的影響 由圖2 A可知，在不同溫度條件處理下，隨著溫度的升高，黑骨藤種子的發芽勢呈逐漸升高的變化趨勢，在30 ℃條件下的黑骨藤種子發芽勢最高，高達54.44%，除30 ℃與25 ℃處理的黑骨藤種子發芽勢之間有顯著差異外(P<0.05)，各處理間的發芽勢兩兩比較均具有極顯著差異性(P<0.01)。

在不同溫度條件處理下，隨著萌發溫度的升高，黑骨藤種子的萌發率呈逐漸上升后下降的變化趨勢。在25 ℃溫度條件下，黑骨藤種子的萌發率最高，高達95%以上，與15 ℃、20 ℃、30 ℃相比分別上升了85.56%、3.34%、5.56%，且除與 20 ℃、30 ℃處理差異不顯著性外(P>0.05)，15 ℃與20 ℃、25 ℃、30 ℃處理的差異均達極顯著差異(P<0.01)。

在不同溫度條件處理下，隨著溫度的升高，黑骨藤種子的發霉率呈先升高后降為零又升高的變化趨勢。15 ℃和25 ℃的發霉率均為0，而30 ℃的發霉率最高(10%)。除30 ℃處理外，15 ℃、20 ℃和25 ℃發霉率之間均不具有顯著性差異(P>0.05)。

2.4.2 不同溫度處理對黑骨藤種子發芽指數的影響 由圖2 B可知，在不同溫度條件下，黑骨藤種子的發芽指數與溫度呈正相關，在15 ℃處理下，黑骨藤種子的發芽指數達最低(2.06)，與20 ℃、25 ℃、30 ℃處理之間差異均達極顯著水平(P<0.01)。由此可知，溫度升高對骨藤種子的活力有促進作用。

2.4.3 不同溫度處理對黑骨藤種子萌發時滯和萌發歷期的影響 由圖2 C可知，在不同溫度條件處理下，黑骨藤種子的萌發時滯和萌發歷期均呈逐漸縮短，25 ℃與30 ℃萌發時滯相同(5.33 d)，25 ℃條件下，黑骨藤種子在第5天便開始萌發，在第19天萌發數便開始不在增加。各溫度條件處理之間的萌發時滯和萌發歷期均不具有顯著性差異(P>0.05)。

通過分析發現，黑骨藤種子萌發的最適溫度區間在20～30 ℃之間。但25 ℃溫度下對種子萌發的促進能力較好，且種子霉變率低，故選擇25 ℃作為黑骨藤種子萌發的最適溫度。

圖2 不同溫度處理對黑骨藤種子萌發特性的影響圖

3 結論與討論

種子在萌發過程中，長時間的水分浸潤下，會出現發霉腐爛的情況，選擇一種合適的種子消毒方法就顯得尤為重要。本研究結果表明，黑骨藤種子最佳的消毒條件為采用5%次氯酸鈉浸泡消毒8 min，其能起到良好的消毒效果且能促進種子的萌發。

不同萌發基質對種子的萌發有一定影響[7]，本研究結果表明，采用不同的萌發基質，對黑骨藤種子的萌發有顯著影響，保水性強的萌發床更適于黑骨藤種子的萌發，其中以濾紙和脫脂棉的萌發率最高。研究顯示，濾紙和紗布都可作為黑骨藤種子萌發的基質，但通過發霉率及萌發效果比較，采用脫脂棉作為萌發床，發霉率低，水分保持狀況良好且萌發效果好，幼苗莖干粗壯，根系發達，故最終選擇脫脂棉作為最佳的萌發基質。

溫度是種子萌發所需的一個極為重要生態條件，它在種子萌發過程中起著重要的作用，是影響種子萌發的主導因子[8]。本研究對溫度條件進行考察，結果表明溫度對黑骨藤種子的萌發有極為顯著的影響，為黑骨藤種子萌發的關鍵因素。本試驗通過對萌發溫度的篩選，認為最適黑骨藤種子萌發的溫度為25 ℃。在25 ℃條件下，種子的發霉率低，萌發率高，且種苗長勢粗壯。

光照也是影響種子萌發的一個重要生態因子。本研究結果表明，在適宜的萌發基質和溫度條件下，從萌發率的角度看，黑骨藤種子在萌發過程中，不采用光照萌發率最高，其對光的需求不強，但從綜合萌發效果等生長指標分析，不同光照時間對黑骨藤種子的萌發均有一定程度的影響，其最適的光照時間為光照16 h/黑暗8 h。選擇合適的光照時長，對種子的萌發起著重要的促進作用。

本研究首次對消毒條件、萌發基質、萌發所需光照及溫度等條件對黑骨藤種子萌發進行了單因素考察，最終通過試驗得出了黑骨藤種子萌發的最適萌發條件，即采用5%次氯酸鈉浸泡消毒8 min，萌發基質為脫脂棉，光照條件為光照16 h/黑暗8 h，萌發溫度為25 ℃。由此為后期的黑骨藤種子萌發實驗提供了參考。