藏藥大花龍膽抗氧化活性成分篩選與鑒定

張國英 耿丹丹 遲曉峰

1.青海省藥品檢驗檢測院，青海 西寧 810016；2.國家藥品監督管理局中藥(藏藥)質量控制重點實驗室，青海 西寧 810016；3.青海省中藏藥現代化研究重點實驗室，青海 西寧 810016；4.河北醫科大學基礎醫學院，河北 石家莊 050017；5.中國科學院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008

上呼吸道感染為鼻腔、咽部和喉部炎癥的總稱，包括普通感冒、流行性感冒、咽炎等，其主要由多病毒(如鼻病毒、流感病毒、冠狀病毒和腺病毒等)感染引起[1]。由于上呼吸道感染中巨噬細胞的異常激活和細胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)信號密切相關，而病毒感染和缺氧引起細胞損傷的機制也和活性氧堆積引起氧化性損傷有關，因此，在常規治療中常輔以抗氧化劑進行治療[2]。研究[3]發現，抗氧化劑可能通過抑制ROS信號依賴的巨噬細胞過度活化、預防缺氧性組織損傷以及減少病毒帶來的細胞損傷。因此，發掘臨床上應用的治療上呼吸道感染的中藏藥材中的天然抗氧化活性成分，有望對上呼吸道感染產生理想的輔助治療作用，為臨床治療提供新的思路。

長期以來，國內中藥效應物質基礎研究的主流模式主要是在化學成分提取、分離和結構鑒定基礎上利用藥理模型對得到的純化合物進行生物活性測試。這樣的研究方法闡明了一些中藥的效應物質基礎，然而該方法費時費力，且原藥材用量較大[19]。近年來，國內外有不少學者建立了中藥藥效物質基礎的生物活性篩選-色譜在線分析方法(如抗氧化劑[20]、乙酰膽堿酯酶抑制劑[21]、α-葡萄糖苷酶抑制劑[22]等)，能夠使效應成分的分離與篩選相結合，克服以往先從中藥中分離單體或有效部位，再分析其藥效，致使成分分離與效應篩選脫節的弊端，大大提高了天然植物活性化合物篩選和鑒定的效率。

基于此，本研究采用HPLC-DPPH-MS/MS在線抗氧化活性篩選體系，對大花龍膽中的抗氧化活性成分進行快速篩選與鑒定，以期為揭示藏藥大花龍膽的活性物質基礎提供基礎數據。

1 材料

1.1 主要儀器 本研究所用主要的儀器包括Agilent 1100 HPLC-MSD液相色譜質譜聯用儀(美國Agilent公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；AG135型精密電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；KQ-100E型超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)；優普UPE-Ⅱ-40 L型超純水機(四川優普超純科技有限公司)；IKA旋轉蒸發儀(德國IKA公司)；定比分流閥(美國IDEX Health &Science 公司)；NP7000半制備色譜色譜儀(江蘇漢邦科技有限公司)；Varian INOVA 600M 核磁共振譜儀(美國Varian公司)。

1.2 主要藥品與試劑 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，批號：STBD4148V)購于德國Sigma公司；甲醇(色譜純)購自德國Merck公司；冰乙酸(分析純)購自天津百世化工有限公司。二丁基羥基甲苯(BHT，批號：BCBN2001V)購于德國Sigma公司；維生素C(批號：100296-201104)購于中國食品藥品檢定研究院；實驗用水為超純水。

大花龍膽采自青海省玉樹藏族自治州稱多縣(N 97.57°；E 34.01°)，由中國科學院西北高原生物研究所遲曉峰副研究員鑒定為大花龍膽(GentianaszechenyiiKanitz)，大花龍膽標本保存于中國科學院西北高原生物研究所青藏高原生物標本館(HNWP)。

2 方法與結果

2.1 實驗條件 本實驗采用實驗室自建HPLC-DPPH-MS/MS抗氧化活性在線篩選體系(如圖1所示)開展抗氧化活性成分篩選測試。具體流程為樣品提取液經HPLC(1)的色譜柱分離，流出液通過定比分流閥被分成大小兩部分，小流速部分(0.2 mL/min)進入二極管陣列檢測器(DAD)檢測；大流速部分(0.8 mL/min)進入PEEK混合池，與HPLC(2)泵入的DPPH自由基溶液混合，樣品中的抗氧化活性成分與DPPH自由基溶液反應后進入紫外檢測器(UV)，在517 nm下進行在線檢測。由于抗氧化劑對DPPH自由基的清除作用造成的其在517 nm下吸收值降低而形成的負峰，對比DAD檢測器獲得的色譜圖與UV檢測器得到的負峰色譜圖，篩選出具有抗氧化活性的化合物，通過MS/MS數據對活性化合物進行鑒定。

圖1 HPLC-DPPH-MS/MS抗氧化活性在線篩選體系

HPLC(1)工作條件：色譜柱，Dikma Diamonsil Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相，0.1%冰乙酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脫，0～60 min，10%～55% B；柱溫，30 ℃；流速，1.0 mL/min；檢測波長254 nm；進樣量,10 μL。質譜工作條件：離子源，電噴霧 ESI，負離子電離模式；霧化氣：N2；霧化氣壓力：40 psi；干燥氣體流速：9 L/min；干燥氣體溫度：325 ℃。

HPLC(2)工作條件:反應環，PEEK反應池(15 m×0.25 mm，江蘇漢邦科技有限公司)；流動相：DPPH甲醇溶液，0.40 mL/min流速等度洗脫；檢測波長517 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 DPPH溶液的配制 稱取DPPH粉末適量，精密稱定(0.0001 g)，配置成濃度為25.0 μg/mL的甲醇溶液。置于4 ℃冰箱中保存，待用。

2.2.2 供試品溶液的配制 稱取干燥的大花龍膽藥材粉末1.0 g，置于錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱重，超聲處理1 h，用甲醇補足失重，0.45 μm濾膜過濾，備用。

2.3 抗氧化活性物質在線篩選 按“2.1”項下篩選條件，對大花龍膽花提取液進行在線抗氧化篩選，所得色譜圖如圖2所示。從圖2中可以看出，快速篩選出共5個主要的抗氧化活性成分。經質譜檢測，5個化合物的分子離子峰及碎片信息見表1。經與文獻比對，化合物1鑒定為為異葒草素[23]，化合物2鑒定為異金雀花素[24]，其結構式如圖3，其余3個化合物通過質譜信息未得到鑒定。

圖2 大花龍膽花在線抗氧化篩選色譜圖

表1 化合物1～5的質譜數據

2.4 抗氧化活性物質分離鑒定 采用半制備液相色譜對化合物3、4、5進行分離純化。制備色譜條件參照“2.1”項下色譜條件，并線性放大。制備色譜柱型號為Megres C18(10 mm×250 mm,5 μm)；流動相：0.1%冰乙酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脫：0～60 min，10%～55% B；柱溫：30 ℃；流速：4.7 mL/min；檢測波長254 nm；進樣量：0.2 mL。在此條件下分離制備得到化合物3(3.59 mg)、化合物4 (2.4 mg)、化合物5 (25.8 mg)，HPLC檢測純度均大于98%。利用美國Varian INOVA 600M 核磁共振譜儀獲得其1H-NMR和13C-NMR 數據，并對其進行結構解析。

化合物3：白色粉末，1H-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ:7.57(1H,s,H-3),7.29(1H,dd,J=1.8 Hz,8.4 Hz,H-6′),7.03(1H,dd,J=1.2 Hz,7.8 Hz,H-4′),6.77(1H,t,J=7.8 Hz,H-5′),5.37(1H,d,J=7.8 Hz,H-7),5.37(3H,d,J=7.8 Hz,OMe),5.27(1H,d,J=4.8 Hz，H-1),4.52(1H,d,J=4.8 Hz,1-glc-1),3.64,3.69(2H×2,m,1-glc-6),3.46(1H,q-like,J=6.7 Hz,H-5),3.15(1H×2,m,1-glc-5),3.14(1H×2,m,1-glc-3),3.05(1H×2,m,1-glc-4),2.98(1H×2,m,1-glc-2),2.35(1H,dd,J=7.8 Hz,13.8 Hz,H-9)，2.15(1H,m,H-8),2.15,1.86(1H,m,H-6),1.06(1H,d,J=6.6 Hz,H-10)。

13C-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ:169.1(C-7′),165.1(C-11),152.4(C-3),149.6(C-2′),146.1(C-3′),120.8(C-4′),119.5(C-6′),119.0(C-5′),113.1(C-1′),110.4(C-4),98.9(1-O-glc-1),95.8(C-1),94.0(glc-1),78.125(C-7),77.8(glc-5),77.3(1-glc-5),76.7(glc-3),76.4(1-glc-3),73.1(1-glc-2),72.4(glc-2),70.0(1-glc-4),69.4(glc-4),61.2(1-glc-6),60.4(glc-6),45.1(C-9),39.9(C-8),38.8(C-6),31.0(C-5),13.3(C-10)。以上數據結合文獻[25]報道確定化合物3為烏奴龍膽苷E。

化合物4：白色粉末，1H-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ:7.49(1H,s,H-3),7.22(1H,dd,J=1.5 Hz,8.0 Hz,H-6″),7.02(1H,dd,J=1.5 Hz,7.8 Hz,H-4″),6.74(1H,dd,J=7.8 Hz,8.0 Hz,H-5″),5.73 (1H,ddd,J=17.5,10.6,8.3 Hz,H-8)，5.51(1H,d,J=7.0 Hz,H-1),5.34 (1H,brd,J=17.5 Hz,H-10),5.24 (1H,brd,J=10.6 Hz,H-10),4.53(1H,d,J=8.0 Hz,H-1′),4.25-4.3 (1H,m,H-7),3.55(3H,s,OMe),3.42,3.67(1H,m,H-6′),3.14 (1H×2,m,H-3′,H-5′),3.01 (1H,m,H-4′),2.95(1H,m,H-2′),2.86 (1H,q-like,J=6.4 Hz,H-6),2.62 (1H,q-like,J=6.8 Hz,H-9),1.87,2.00 (1H,m,H-6)。

13C-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ:169.4(C-7″),166.6(C-11),152.2(C-3),149.5(C-2″),146.0(C-3″),134.5(C-8),120.7(C-4″),119.5(C-6″),119.1(C-10),118.8(C-5″),113.0(C-1″),109.4(C-4),98.7(C-1′),95.6(C-1),77.3(C-5′),76.6(C-3′),73.0(C-2′),70.0(C-4′),63.7(C-7),61.2(C-6′),51.0(OMe),43.1(C-9),29.0(C-5),28.7(C-6)。以上數據結合文獻[26]報道確定化合物4為為大花龍膽苷B。

化合物5：白色粉末，1H-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ:7.46 (1H,s,H-3′),7.41(1H,s,H-3),7.03(1H,dd,J=1.3,7.8 Hz,H-4″),6.75(1H,t,J=7.9 Hz,H-5″),5.68(1H,ddd,J=8.4,10.8,18 Hz H-8′),5.48(1H,d,J=7.0 Hz,H-1′),5.34(1H,t,J=4.8 Hz H-7),5.24(1H,d,J=4.8 Hz,H-1),5.17,5.28(2H,brd,J=10.6,17.4 Hz,H-10′),4.52(1H×2,d,J=4.8 Hz,1-glc-1,1′-glc-1),4.26,4.35(2H,m,H-7′),3.41,3.67(2H×2,m,glc-6),3.14(1H×2,m,glc-3),3.14(1H×2,m,glc-5),3.04(1H,m,J=8.5Hz,H-5),3.01(1H×2,m,glc-4),2.94(1H×2,m,glc-2),2.56 (1H,q-like,J=7.2 Hz,H-9′),2.77(1H,q-like,J=6.6 Hz,H-5′),2.32(1H,q-like,J=7.8 Hz,H-9),2.15 (1H,m,H-8),2.15,1.82 (1H,m,H-6),1.74,2.05(2H,m,H-6′),1.06 (1H,d,J=7.2 Hz,H-10)。

13C-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ:169.1(C-7″),166.6(C-11),166.6(C-11′) 152.1(C-3′),151.0(C-3),149.7(C-2″),146.1(C-3″),134.6(C-8′),120.8(C-4″),119.5(C-6″),119.0(C-10′),118.8(C-5″),113.1(C-1″),111.1(C-4),109.6(C-4′),98.7(1-glc-1),98.7(1′-glc-1),95.6(C-1),95.6(C-1′),78.2(C-7),77.3(1′-glc-5),77.3(1-glc-5),76.6(1-glc-1),76.6 (1′-glc-1),73.1 (1-glc-2),73.1 (1′-glc-2),70.0 (1-glc-4),70.0 (1′-glc-4),62.0 (C-7′),61.2(1-glc-6),61.2(1′-glc-6),51.1(OMe),45.1(C-9),43.1(C-9″),39.9(C-8),38.8(C-6),31.1(C-5′),29.8(C-5),29.0(C-6′),13.3(C-10)。以上數據結合文獻[25]報道確定化合物5為烏奴龍膽苷A。

化合物3、4、5的化學結構如圖3所示。

圖3 化合物1～5的化學結構圖A.異葒草素；B.異金雀花素；C.烏奴龍膽苷E；D.大花龍膽苷B；E.烏奴龍膽苷A

2.5 抗氧化活性測試 采用DPPH比色法測定上述5個化合物的抗氧化活性。分別精密稱定BHT、維生素C對照品以及異葒草素、異金雀花素、烏奴龍膽苷E、大花龍膽苷B和烏奴龍膽苷A的純度大于98%自制品約1 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，待用。分別取上述對照品溶液0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL、2 mL于具塞試管中，用甲醇稀釋至2 mL，搖勻。得到5種不同濃度的供試品溶液。精密吸取0.1 mmol/L DPPH溶液2 mL與2 mL供試品溶液于一具塞試管中震蕩搖勻，置于暗處反應30 min，5000 r/min離心10 min后，取上清液于517 nm下測其吸光度值Asample；測0.1 mmol/L DPPH溶液2 mL與甲醇2 mL混合后的吸光度值Acontrol；測甲醇2 mL與供試品溶液2 mL混合后的吸光度值Ablank，并用BHT和維生素C作為對照。利用GraphPad Prism 5軟件計算其IC50值，結果見表2。

DPPH自由基清除率(%)=

(1)

由表2可知，五個化合物均表現出較強的抗氧化活性，其中烏奴龍膽苷A的IC50值最低，抗氧化能力最強，而大花龍膽苷B的抗氧化能力最弱。各化合物抗氧化能力大小排序為：維生素C>烏奴龍膽苷E>異紅草素>烏奴龍膽苷A>異金雀花素>大花龍膽苷B>BHT。

表2 化合物的抗氧化能力

3 討論

3.1 在線抗氧化活性成分的篩選條件優化 本研究所用HPLC-DPPH-MS/MS在線抗氧化活性成分篩選是在前期實驗室建立的在線抗氧化篩選體系基礎上進行了適當修改[20]。不同藥材其活性成分種類、含量以及抗氧化活性大小均具有較大差異。同時不同的色譜分離體系對該篩選方法的靈敏度、基線噪音等都有一定的影響。因此，本實驗對DPPH的濃度、體積流量、反應池的規格等因素進行了優化。研究中通過對比 DPPH 溶液濃度(10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL、30 μg/mL)和體積流量(0.2 mL/min、0.3 mL/min、0.4 mL/min、0.5 mL/min)對篩選篩選效果的影響，結果表明隨著DPPH 濃度和體積流量的增大，方法靈敏度有逐漸增加趨勢，但較高的濃度和體積流量會造成基線波動，影響篩選效果，因此，選擇DPPH 溶液濃度25 μg/mL，體積流量為0.4 mL/min 作為最適濃度和體積流量用于后續篩選。反應池規格會影響反應時間的長短，從而影響篩選效果。本實驗對反應池內徑(0.13 mm、0.18 mm、0.25 mm)和長度(5 m、10 m、15 m、20 m)進行優化分析。研究結果表明，反應管越長、內徑越大，產生DPPH 倒峰的響應越高，但同時較長的反應時間會造成色譜分離度下降，方法分辨率降低。綜合考慮以上因素，最終確定內徑為0.25 mm，長度為10 m 的PEEK 管為該篩選試驗實驗最適反應池。

3.2 抗氧化活性與構效關系分析 從大花龍膽中分離得到的5化合物包含兩個黃酮碳苷類物質(異葒草素、異金雀花素)和3個環烯醚萜苷類物質(烏奴龍膽苷E、大花龍膽苷B和烏奴龍膽苷A)。研究[20,27-28]證實，黃酮類和環烯醚萜類均是優良的天然抗氧化劑。

抗氧化活性強弱與化合物的化學結構有密切的關系[29-30]。影響黃酮、環烯醚萜等多羥基類化合物的抗氧化活性強弱的因素主要有以下幾點：酚羥基的取代數目和位置、雙鍵位置、羥基的苷化以及化合物的空間結構等[31-33]。

異葒草素和異金雀花素的抗氧化活性具有明顯的差異，而這兩個化合物的結構僅在3′位置存在差異，其中異葒草素為-OH，異金雀花素為-OCH3基團，即-OH基團甲基化后抗氧化活性降低。在槲皮苷(槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷)和異鼠李素-3-O-α-L-鼠李糖苷抗氧化活性比較中也呈現出相同的趨勢[34]。因此，筆者推測3′-OH與相鄰的4′-OH形成鄰二羥基結構，該結構可能是決定抗氧化活性高低的一個重要因素。

烏奴龍膽苷E、大花龍膽苷B和烏奴龍膽苷A的抗氧化活性也呈現出一定的差異。烏奴龍膽苷E為馬錢素型的環烯醚萜苷，大花龍膽苷B為裂番木鱉酸型環烯醚萜苷，烏奴龍膽A是二聚環烯醚萜苷，三者結構具有較大差異尤其是大花龍膽苷B的空間構象與烏奴龍膽苷E和烏奴龍膽苷A呈現較大差異，這些結構及空間構象的差異可能導致其抗氧化活性也呈現顯著差異[32]。