基因工程菌Streptomyces bingchenggensis BCJ60的次級代謝產物研究

李建宋，李 亞，郝之奎，張明濤，王繼棟，向文勝

1臺州職業技術學院醫學與制藥工程學院；2浙江海正藥業股份有限公司，臺州 318000；3湖州師范學院生命科學學院，湖州 313000；4東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030

聚酮類化合物主要是由聚酮合酶催化將低級羧酸通過連續的縮合反應產生的一類天然產物，包括大環內酯、四環素、蒽醌和聚醚等[1，2]。從藥理學的角度來看，聚酮類化合物是新型藥物的重要來源，主要用作抗生素、免疫抑制劑、抗寄生蟲、降膽固醇和抗腫瘤藥物[3]。聚酮合酶每個結構域的功能都與最終產物的結構呈現對應關系，因而，可以利用這種對應關系來編輯生物合成基因，從而設計合成產物，由此產生出一個嶄新的研究領域——聚酮合酶的組合生物學[4]。學者們主要通過減少、增加或者替換聚酮合酶的模塊及模塊中的結構域來組合產生新的產物，如通過對鏈霉菌Streptomycesavermitilis中聚酮合酶基因簇aveLAT-ACP進行改造獲得一株基因工程菌，從該工程菌次級代謝產物中分離獲得兩個新的阿維菌素衍生物25-甲基伊維菌素和25-乙基伊維菌素[5]。

本課題組在前期的研究中，對冰城鏈霉菌StreptomycesbingchenggensisBC-120-4中編碼聚酮合酶的milF基因進行改造得到基因工程菌株StreptomycesbingchenggensisBCJ60，該菌株不能編碼C-5酮基還原酶，從而阻斷米爾貝霉素 A3/A4/B2/B3的合成[6]。通過基因定向改造，生物合成基因簇發生改變，有可能激活了某些生物合成途徑得到新的代謝產物。因此，本研究主要對基因工程菌株StreptomycesbingchenggensisBCJ60的次級代謝產物進行研究，以期獲得具有應用價值的高效殺蟲抗生素。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀Agilent 1260(美國安捷倫科技有限公司)；超導核磁共振儀Bruber AVANCE-400(德國Bruker公司)；旋轉蒸發儀RE2000(上海亞榮儀器有限公司)；發酵罐100 L(上海保興生物設備有限公司)；凝膠Sephadex LH-20(美國Pharmacia 公司)；正相硅膠(100～200目)(青島海洋化工廠)；薄層層析(TLC)用硅膠板(煙臺新諾化工有限公司)；甲醇、乙醇、二氯甲烷等試劑均為分析純，購于臺州市椒江中西化工有限公司；酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、大豆餅粉等培養基購于中國新興化工試劑研究所；NaCl、KNO3等無機鹽購于浙江臨安化工試劑廠。

1.2 菌株來源

基因工程菌株StreptomycesbingchenggensisBCJ60，由本實驗室保存，該菌株是由冰城鏈霉菌Streptomycesbingchenggensis經誘變和基因改造獲得[6]。

1.3 菌株培養

1.3.1 斜面培養

培養基組成：可溶性淀粉20 g，NaCl 0.5 g，KNO31 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。于121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min，接種后在28 ℃下培養7天。

1.3.2 種子培養

培養基組成：蔗糖10 g，脫脂奶粉1 g，酵母提取物5 g，蛋白胨3.5 g，K2HPO40.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。用1 000 mL的三角瓶每瓶分裝250 mL的上述培養基。向長有孢子的斜面上，加入9 mL無菌水，用無菌的接種鏟刮下培養基表面的孢子制成孢子懸浮液接于種子培養基中培養，28 ℃，250 rpm震蕩培養24 h。

1.3.3 發酵培養

培養基組成：黃豆餅粉20 g，蔗糖80 g，脫脂奶粉1 g，FeSO4·7H2O 0.1 g，K2HPO4·3H2O 1 g，CaCO33 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。采用100 L發酵罐，按8%接種量，將種子液接入到100 L發酵罐中(60 L培養基)，28 ℃，100 r/min震蕩培養6～7天。

1.4 提取、分離與鑒定

發酵液60 L經離心得到菌絲體12 L，菌絲體用去離子水洗滌后再用40 L甲醇浸提兩次，每次攪拌4 h，過濾合并甲醇浸提液，50 ℃減壓濃縮至干，得到52.0 g油狀物質。將所得的油狀物質上硅膠(100～200目)層析，石油醚∶丙酮 = 100∶0→60∶40(V/V)梯度洗脫，流速30 mL/min，收集洗脫液，每份250 mL，薄層層析(TLC)檢測(石油醚∶丙酮 = 2∶1)，得到四個組分Fr.1～4。Fr.1(12.5 g)上凝膠Sephadex LH-20(二氯甲烷∶甲醇 = 1∶1)層析獲得化合物3(7.5 mg)、4(6.8 mg)、5(8.3 mg)和6(7.9 mg)。Fr.2(9.7 g)上凝膠Sephadex LH-20(二氯甲烷∶甲醇 = 1∶1)得到含有化合物1和2的混合物，進一步上Agilent 1260高壓液相色譜層析，色譜柱Agilent Zorbax SB C3 column(5 μm，250 mm× 9.4 mm)，洗脫劑甲醇∶乙腈∶水 = 42∶42∶16(V/V/V)，流速1.5 mL/min，檢測波長λ= 240 nm，得到化合物1(9.5 mg，tR= 19.4 min)和化合物2(8.3 mg，tR= 23.2 min)。Fr.3(8.3 g)上凝膠Sephadex LH-20(二氯甲烷∶甲醇 = 1∶1)層析獲得化合物7(6.3 mg)、8(7.3 mg)和9(6.7 mg)。Fr.4(5.6 g)經反向硅膠柱色譜梯度洗脫(甲醇∶水 = 30%→90%)得到化合物10(6.5 mg)和11(8.4 mg)。化合物結構采用一維、二維核磁共振、質譜、高分辨質譜等波譜學方法以及對比文獻數據進行鑒定。

1.5 殺蟲活性測試

1.5.1 殺螨蟲活性測試

將化合物用甲醇溶解，用含0.01%表面活性劑烷基酚聚氧乙烯醚的水稀釋10倍，制成100 mg/mL的溶液，再依次稀釋得到1、0.5、0.25、0.1、0.05和0.025 mg/mL的溶液作為樣品溶液。將對有機磷類殺蟲藥敏感的朱砂葉螨接種到豇豆的初生葉上。接種一天后，將豇豆的葉子浸泡在樣品溶液中1～2 s。將葉子在25 ℃放置3天后，用顯微鏡觀察存活成蟲的個數，計算死亡率(%)。設置對照組，以米爾貝霉素A3和A4(30∶70，V/V)作為陽性對照。

1.5.2 殺線蟲活性測試

將化合物用甲醇溶解，再用水稀釋成100 mg/mL的溶液，再依次稀釋得到10、5、2、1、0.5、0.25、0.1和0.05 mg/mL的溶液。分別取不同濃度溶液10 μL加入到90 μL含活松材線蟲水懸液中。混合液震蕩后在25 ℃放置15 h。在顯微鏡下計數不動線蟲的數量和測試線蟲的總數，計算測試線蟲的死亡率(%)。設置對照組，以米爾貝霉素A3和A4(30∶70，V/V)作為陽性對照。

1.5.3 數據處理

以上每組實驗設置三個平行實驗組，結果取平均值。用統計軟件SPSS 13.0計算半數致死量LC50(mg/L)，Student’st-test檢驗P值，觀察與陽性對照米爾貝霉素A3/A4的活性差異，如果P>0.05則認為無顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 化合物結構鑒定

圖1 化合物1～11的化學結構

在NOESY譜中H-2/H-4存在氫氫遠程相關信號，說明H-2和H-4空間朝向一致；H-3/H3-26存在氫氫遠程相關信號，說明H-3和H3-26空間朝向一致；H-10和H-11之間較大的耦合常數(δH14.3 Hz)以及H3-27/H-10，H3-29/H2-16之間NOESY信號表明C-8/C-9，C-10/C-11，C-14/C-15是三個反式雙鍵；H-17/H-25，H3-30/H-25，H-17/H-19之間的NOESY信號表明H-17、H-19、H-25和H-30有相同的空間朝向。C-6、C-7、C-12和C-21位手性中心的相對構型通過與5-oxomilbemycin A3對比確認。

圖2 化合物1和2的主要1H-1H COSY和HMBC相關信號

圖3 化合物1的主要NOESY相關信號

表1 化合物1和2的1H和13C NMR數據

化合物3白色粉末狀固體；易溶于氯仿、甲醇、丙酮，難溶于水；ESI-MS：m/z509.1[M-H]-，分子式為C31H42O6。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.77(1H，s，H-3)，7.01(1H，s，H-6)，6.48(1H，d，J= 11.0 Hz，H-9)，6.19(1H，dd，J= 14.8，11.0 Hz，H-10)，5.96(1H，dd，J= 14.8，6.6 Hz，H-11)，5.05(2H，s，H-27)，4.24(1H，m，H-19)，3.60(1H，m，H-17)，3.25(1H，m，H-25)，2.53(1H，m，H-12)，2.28(2H，m，H-16)，2.20(2H，m，H-13)，2.20(3H，s，H-26)，2.11(1H，m，H-18)，2.08(1H，m，H-20)，1.65(1H，m，H-22)，1.62(3H，br s，H-29)，1.54(1H，m，H-22)，1.50(2H，m，H-23)，1.34(1H，br t，J= 12.0 Hz，H-20)，1.24(1H，m，H-24)，1.20(1H，m，H-18)，1.10(3H，d，J= 5.8 Hz，H-31)，1.08(3H，d，J= 6.2 Hz，H-28)，0.82(3H，d，J= 6.5 Hz，H-30)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：165.8(C-1)，114.5(C-2)，133.2(C-3)，126.1(C-4)，160.5(C-5)，107.5(C-6)，138.2(C-7)，123.6(C-8)，128.0(C-9)，121.7(C-10)，146.4(C-11)，33.8(C-12)，48.2(C-13)，135.4(C-14)，122.3(C-15)，34.3(C-16)，68.1(C-17)，40.3(C-18)，65.8(C-19)，44.7(C-20)，97.6(C-21)，35.8(C-22)，27.8(C-23)，36.6(C-24)，71.3(C-25)，15.6(C-26)，66.7(C-27)，19.4(C-28)，16.1(C-29)，17.9(C-30)，19.4(C-31)。以上數據與文獻[7]報道基本一致，因此鑒定化合物3為seco-milbemycin C。

化合物4白色粉末狀固體；易溶于氯仿、甲醇、丙酮，難溶于水；ESI-MS：m/z523.3[M-H]-，分子式為C32H44O6。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.78(1H，s，H-3)，7.02(1H，s，H-6)，6.51(1H，d，J= 11.0 Hz，H-9)，6.17(1H，dd，J= 14.8，11.0 Hz，H-10)，5.97(1H，dd，J= 14.8，6.6 Hz，H-11)，5.11(1H，t，J= 7.0 Hz，H-15)，5.05(2H，s，H-27)，4.24(1H，m，H-19)，3.63(1H，m，H-17)，3.25(1H，m，H-25)，2.53(1H，m，H-12)，2.28(2H，m，H-16)，2.20(2H，m，H-13)，2.20(3H，s，H-26)，2.11(1H，m，H-18)，2.08(1H，m，H-20)，1.65(1H，m，H-22)，1.62(1H，m，H-31)，1.62(3H，br s，H-29)，1.54(1H，m，H-22)，1.50(2H，m，H-23)，1.34(1H，br t，J= 12.0 Hz，H-20)，1.24(1H，m，H-24)，1.25(1H，m，H-31)，1.20(1H，m，H-18)，1.08(3H，d，J= 6.2 Hz，H-28)，0.92(3H，t，J= 6.2 Hz，H-32)，0.82(3H，d，J= 6.5 Hz，H-30)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：165.6(C-1)，114.5(C-2)，133.1(C-3)，126.2(C-4)，160.6(C-5)，107.4(C-6)，138.3(C-7)，123.5(C-8)，128.1(C-9)，121.8(C-10)，146.6(C-11)，33.7(C-12)，48.3(C-13)，135.5(C-14)，122.5(C-15)，34.2(C-16)，68.0(C-17)，40.1(C-18)，65.7(C-19)，44.8(C-20)，97.5(C-21)，35.7(C-22)，27.8(C-23)，36.5(C-24)，71.4(C-25)，15.6(C-26)，66.8(C-27)，19.5(C-28)，16.1(C-29)，17.9(C-30)，25.6(C-31)，10.3(C-32)。以上數據與文獻[8]報道基本一致，因此鑒定化合物4為seco-milbemycin A。

化合物5白色粉末狀固體；易溶于氯仿、甲醇、丙酮，難溶于水；ESI-MS：m/z541.1[M + H]+，分子式為C33H48O6。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：6.42(1H，br s，H-3)，6.25(1H，d，J= 11.8 Hz，H-9)，6.03(1H，dd，J= 14.8，11.8 Hz，H-10)，5.38(1H，d，J= 14.8，9.1 Hz，H-11)，5.36(1H，m，H-19)，4.83(1H，br d，J= 10.0 Hz，H-15)，3.75(1H，m，H-17)，3.61(1H，br d，H-2)，3.38(1H，s，H-6)，3.06(1H，dd，J= 9.6，2.0 Hz，H-25)，2.50(1H，m，H-12)，2.43(1H，m，H-13)，2.42(1H，s，H-6)，2.31(1H，m，H-16)，2.23(1H，m，H-16)，2.01(1H，m，H-18)，1.98(1H，m，H-20)，1.94(3H，s，H-27)，1.87(1H，m，H-13)，1.84(3H，s，H-26)，1.65(1H，m，H-22)，1.64(3H，s，H-29)，1.53(1H，m，H-22)，1.52(2H，m，H-23)，1.50(1H，m，H-31)，1.43(1H，m，H-20)，1.32(1H，m，H-24)，1.03(3H，d，J= 6.7 Hz，H-28)，0.89(3H，d，J= 6.2 Hz，H-32)，0.84(3H，d，J= 6.2 Hz，H-33)，0.79(1H，q，J= 11.8 Hz，H-18)，0.79(3H，d，J= 6.5 Hz，H-30)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：173.5(C-1)，49.2(C-2)，118.1(C-3)，139.6(C-4)，198.1(C-5)，41.6(C-6)，75.9(C-7)，124.0(C-8)，123.8(C-9)，126.4(C-10)，144.6(C-11)，36.1(C-12)，48.3(C-13)，137.5(C-14)，122.3(C-15)，34.2(C-16)，67.0(C-17)，36.6(C-18)，70.0(C-19)，41.3(C-20)，97.5(C-21)，35.7(C-22)，27.8(C-23)，31.5(C-24)，78.2(C-25)，18.8(C-26)，19.8(C-27)，14.2(C-28)，16.3(C-29)，17.9(C-30)，28.6(C-31)，14.2(C-32)，20.9(C-33)。以上數據與文獻[9]報道基本一致，因此鑒定化合物5為米爾貝霉素H。

化合物6白色粉末狀固體；易溶于氯仿、甲醇、丙酮，難溶于水；ESI-MS：m/z509.3[M-H]-，分子式為C31H42O6。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.38(1H，s，H-3)，6.70(1H，s，H-6)，6.24(1H，dd，J= 14.9，11.0 Hz，H-10)，5.82(1H，d，J= 11.0 Hz，H-9)，5.50(1H，m，H-19)，5.42(1H，dd，J= 14.9，6.6 Hz，H-11)，4.91(1H，t，J= 9.7 Hz，H-15)，4.56(1H，d，J= 10.0 Hz，H-27)，4.53(1H，d，J= 10.0 Hz，H-27)，3.71(1H，m，H-17)，3.30(1H，m，H-25)，2.53(1H，m，H-12)，2.34(1H，m，H-16)，2.25(1H，m，H-13)，2.25(1H，m，H-16)，2.22(3H，s，H-26)，2.14(1H，m，H-18)，2.02(1H，m，H-20)，1.86(1H，br t，J= 12.4 Hz，H-13)，1.65(1H，m，H-22)，1.64(3H，br s，H-29)，1.54(1H，m，H-22)，1.54(2H，m，H-23)，1.44(1H，br t，J= 12.0 Hz，H-20)，1.24(1H，m，H-24)，1.15(3H，d，J= 6.2 Hz，H-31)，1.07(3H，d，J= 6.2 Hz，H-28)，0.87(1H，m，H-18)，0.85(3H，d，J= 6.5 Hz，H-30)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：169.2(C-1)，123.7(C-2)，132.1(C-3)，123.2(C-4)，156.6(C-5)，114.4(C-6)，140.6(C-7)，136.1(C-8)，131.8(C-9)，123.8(C-10)，143.1(C-11)，35.7(C-12)，48.7(C-13)，135.5(C-14)，121.5(C-15)，33.8(C-16)，67.6(C-17)，36.6(C-18)，68.7(C-19)，41.3(C-20)，97.8(C-21)，35.8(C-22)，27.8(C-23)，36.5(C-24)，71.3(C-25)，15.5(C-26)，61.5(C-27)，20.9(C-28)，16.1(C-29)，17.9(C-30)，19.3(C-31)。以上數據與文獻[10]報道基本一致，因此鑒定化合物6為米爾貝霉素β13。

化合物7白色粉末狀固體；易溶于氯仿、甲醇、丙酮，難溶于水；ESI-MS：m/z539.3[M + H]+，分子式為C32H42O7。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.74(3H，s，H-27)，7.57(1H，s，H-3)，6.83(1H，d，J= 15.6 Hz，H-9)，6.15(1H，dd，J= 15.6，8.9 Hz，H-10)，5.63(1H，m，H-19)，5.33(1H，t，J= 7.7 Hz，H-15)，4.39(1H，d，J= 8.9 Hz，H-11)，3.93(1H，m，H-17)，3.12(1H，m，H-25)，2.42(1H，m，H-16)，2.31(3H，s，H-26)，2.30(1H，m，H-16)，2.16(1H，m，H-20)，2.14(1H，m，H-18)，2.10(2H，m，H-13)，1.84(1H，m，H-12)，1.73(3H，br s，H-29)，1.67(1H，m，H-31)，1.65(1H，m，H-22)，1.54(1H，m，H-22)，1.50(2H，m，H-23)，1.40(1H，m，H-18)，1.35(1H，m，H-31)，1.34(1H，m，H-20)，1.34(1H，m，H-24)，1.03(3H，d，J= 6.9 Hz，H-28)，1.01(3H，t，J= 6.2 Hz，H-32)，0.85(3H，d，J= 6.5 Hz，H-30)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：167.3(C-1)，117.2(C-2)，129.6(C-3)，119.6(C-4)，142.4(C-5)，142.3(C-6)，123.5(C-7)，120.0(C-8)，126.8(C-9)，126.4(C-10)，86.6(C-11)，40.1(C-12)，43.3(C-13)，137.5(C-14)，122.3(C-15)，33.2(C-16)，67.0(C-17)，35.6(C-18)，70.0(C-19)，41.3(C-20)，97.5(C-21)，35.7(C-22)，27.8(C-23)，34.5(C-24)，76.2(C-25)，14.8(C-26)，144.4(C-27)，14.2(C-28)，18.3(C-29)，17.9(C-30)，25.6(C-31)，10.2(C-32)。以上數據與文獻[11]報道基本一致，因此鑒定化合物7為米爾貝霉素ST906。

化合物8白色粉末狀固體；易溶于氯仿、甲醇、丙酮，難溶于水；ESI-MS：m/z495.1[M + H]+，分子式為C31H42O5。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.37(1H，s，H-3)，6.61(1H，s，H-6)，6.15(1H，dd，J= 15.0，10.9 Hz，H-10)，5.71(1H，d，J= 10.9 Hz，H-9)，5.49(1H，m，H-19)，5.29(1H，d，J= 15.0，9.1 Hz，H-11)，4.90(1H，br d，J= 10.1 Hz，H-15)，3.63(1H，m，H-17)，3.10(1H，m，H-25)，2.60(3H，s，H-26)，2.50(1H，m，H-12)，2.31(1H，m，H-16)，2.23(1H，m，H-16)，2.21(1H，m，H-13)，2.07(3H，s，H-27)，2.01(1H，m，H-18)，1.98(1H，m，H-20)，1.87(1H，m，H-13)，1.65(1H，m，H-22)，1.64(3H，s，H-29)，1.53(1H，m，H-22)，1.52(2H，m，H-23)，1.43(1H，m，H-20)，1.32(1H，m，H-24)，1.10(3H，d，J= 5.8 Hz，H-31)，1.03(3H，d，J= 6.7 Hz，H-28)，0.85(3H，d，J= 6.5 Hz，H-30)，0.79(1H，q，J= 11.8 Hz，H-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：169.1(C-1)，123.5(C-2)，132.0(C-3)，123.2(C-4)，156.4(C-5)，114.3(C-6)，140.7(C-7)，136.2(C-8)，131.7(C-9)，123.6(C-10)，143.2(C-11)，35.7(C-12)，48.7(C-13)，135.6(C-14)，121.4(C-15)，33.8(C-16)，67.5(C-17)，36.6(C-18)，68.8(C-19)，41.2(C-20)，97.9(C-21)，35.8(C-22)，27.7(C-23)，36.6(C-24)，71.2(C-25)，15.5(C-26)，16.8(C-27)，20.8(C-28)，16.2(C-29)，17.9(C-30)，19.3(C-31)。以上數據與文獻[12]報道基本一致，因此鑒定化合物8為米爾貝霉素β3。

化合物9白色粉末狀固體；易溶于氯仿、甲醇、丙酮，難溶于水；ESI-MS：m/z507.4[M-H]-，分子式為C32H44O5。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.37(1H，s，H-3)，6.62(1H，s，H-6)，6.14(1H，dd，J= 15.0，10.9 Hz，H-10)，5.72(1H，d，J= 10.9 Hz，H-9)，5.49(1H，m，H-19)，5.28(1H，d，J= 15.0，9.1 Hz，H-11)，4.90(1H，br d，J= 10.1 Hz，H-15)，3.63(1H，m，H-17)，3.10(1H，m，H-25)，2.60(3H，s，H-26)，2.50(1H，m，H-12)，2.31(1H，m，H-16)，2.23(1H，m，H-16)，2.21(1H，m，H-13)，2.07(3H，s，H-27)，2.01(1H，m，H-18)，1.98(1H，m，H-20)，1.87(1H，m，H-13)，1.67(3H，m，H-31)，1.65(1H，m，H-22)，1.64(3H，s，H-29)，1.53(1H，m，H-22)，1.52(2H，m，H-23)，1.43(1H，m，H-20)，1.35(2H，m，H-31)，1.32(1H，m，H-24)，1.03(3H，d，J= 6.7 Hz，H-28)，1.01(3H，t，J= 6.2 Hz，H-32)，0.85(3H，d，J= 6.5 Hz，H-30)，0.79(1H，q，J= 11.8 Hz，H-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：168.9(C-1)，123.9(C-2)，132.1(C-3)，123.4(C-4)，156.7(C-5)，114.4(C-6)，140.8(C-7)，136.3(C-8)，131.8(C-9)，123.9(C-10)，143.0(C-11)，35.7(C-12)，48.8(C-13)，135.6(C-14)，121.6(C-15)，33.8(C-16)，67.6(C-17)，36.7(C-18)，68.8(C-19)，41.4(C-20)，97.6(C-21)，35.7(C-22)，27.9(C-23)，34.4(C-24)，76.3(C-25)，15.5(C-26)，18.5(C-27)，20.9(C-28)，16.1(C-29)，17.9(C-30)，25.8(C-31)，10.1(C-32)。以上數據與文獻[10]報道基本一致，因此鑒定化合物9為25-ethylmilbemycinβ3。

化合物10白色粉末狀固體；易溶于氯仿、甲醇、丙酮，難溶于水；ESI-MS：m/z525.3[M-H]-，分子式為C32H46O6。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：6.38(1H，s，H-3)，6.28(1H，d，J= 11.9 Hz，H-9)，6.01(1H，dd，J= 15.0，11.9 Hz，H-10)，5.38(1H，d，J= 15.0，9.1 Hz，H-11)，5.34(1H，m，H-19)，4.84(1H，br d，J= 10.1 Hz，H-15)，3.63(1H，m，H-17)，3.59(br d，H-2)，3.38(1H，s，H-6)，3.10(1H，m，H-25)，2.50(1H，m，H-12)，2.40(1H，s，H-6)，2.31(1H，m，H-16)，2.23(1H，m，H-16)，2.21(1H，m，H-13)，2.01(1H，m，H-18)，1.98(1H，m，H-20)，1.94(3H，s，H-27)，1.87(1H，m，H-13)，1.84(3H，s，H-26)，1.67(1H，m，H-31)，1.65(1H，m，H-22)，1.64(3H，s，H-29)，1.53(1H，m，H-22)，1.52(2H，m，H-23)，1.43(1H，m，H-20)，1.35(1H，m，H-31)，1.32(1H，m，H-24)，1.03(3H，d，J= 6.7 Hz，H-28)，1.01(3H，t，J= 6.2 Hz，H-32)，0.85(3H，d，J= 6.5 Hz，H-30)，0.79(1H，q，J= 11.8 Hz，H-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：173.1(C-1)，48.6(C-2)，136.1(C-3)，136.4(C-4)，196.6(C-5)，47.6(C-6)，75.6(C-7)，135.1(C-8)，148.6(C-9)，121.6(C-10)，153.1(C-11)，36.7(C-12)，48.6(C-13)，136.5(C-14)，121.4(C-15)，34.4(C-16)，67.5(C-17)，36.6(C-18)，68.8(C-19)，40.7(C-20)，97.8(C-21)，35.7(C-22)，27.6(C-23)，36.6(C-24)，71.2(C-25)，15.5(C-26)，16.6(C-27)，21.1(C-28)，16.1(C-29)，25.7(C-31)，10.2(C-32)。以上數據與文獻[10]報道基本一致，因此鑒定化合物10為米爾貝霉素β6。

化合物11白色粉末狀固體；易溶于氯仿、甲醇、丙酮，難溶于水；HR-ESI-MS：535.306 1[M + Na]+(calcd for C31H44NaO6，535.307 4)，分子式為C31H44O6。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：6.38(1H，s，H-3)，6.28(1H，d，J= 11.9 Hz，H-9)，6.01(1H，dd，J= 15.0，11.9 Hz，H-10)，5.38(1H，d，J= 15.0，9.1 Hz，H-11)，5.34(1H，m，H-19)，4.84(1H，br d，J= 10.1 Hz，H-15)，3.63(1H，m，H-17)，3.59(1H，br d，H-2)，3.38(1H，s，H-6)，3.25(1H，m，H-25)，2.50(1H，m，H-12)，2.40(1H，s，H-6)，2.31(1H，m，H-16)，2.23(1H，m，H-16)，2.21(1H，m，H-13)，2.01(1H，m，H-18)，1.98(1H，m，H-20)，1.94(3H，s，H-27)，1.87(1H，m，H-13)，1.84(3H，s，H-26)，1.65(1H，m，H-22)，1.64(1H，s，H-29)，1.53(1H，m，H-22)，1.52(2H，m，H-23)，1.43(1H，m，H-20)，1.23(1H，m，H-24)，1.11(3H，m，H-31)，1.03(3H，d，J= 6.7 Hz，H-28)，0.85(3H，d，J= 6.5 Hz，H-30)，0.79(1H，q，J= 11.8 Hz，H-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：173.0(C-1)，48.5(C-2)，136.0(C-3)，136.2(C-4)，196.4(C-5)，47.6(C-6)，75.7(C-7)，135.2(C-8)，148.7(C-9)，121.6(C-10)，153.2(C-11)，36.7(C-12)，48.7(C-13)，136.6(C-14)，121.4(C-15)，34.4(C-16)，67.5(C-17)，36.6(C-18)，68.8(C-19)，40.7(C-20)，97.9(C-21)，35.8(C-22)，27.6(C-23)，36.6(C-24)，71.2(C-25)，15.5(C-26)，16.6(C-27)，21.1(C-28)，16.1(C-29)，17.9(C-30)，19.2(C-31)。以上數據與文獻[10]報道基本一致，因此鑒定化合物11為米爾貝霉素β7。

2.2 化合物殺蟲活性測試

對化合物1和2殺蟲活性測試結果(見表2)顯示該兩個化合物對朱砂葉螨和松材線蟲都具有顯著的殺滅活性，與陽性對照組米爾貝霉素A3/A4活性相比無顯著性差異(P> 0.05)。

表2 化合物1和2的殺螨和殺線蟲活性

3 討論與結論

本文通過對基因工程菌StreptomycesbingchenggensisBCJ60次級代謝產物進行了系統的研究，得到11個化合物，其中化合物1和2是兩個新化合物。在之前的研究中，本課題組已對基因工程菌StreptomycesbingchenggensisBCJ60次級代謝產物進行了初步的研究獲得了12個新化合物，并且都是米爾貝霉素類化合物[13-18]。這說明通過基因定向改造，生物合成基因簇發生改變，激活了某些生物合成途徑，得到新的代謝產物，有助于進一步了解米爾貝類化合物生物合成機制。對新化合物殺蟲活性實驗表明，化合物1和2對朱砂葉螨和松材線蟲都表現了顯著的殺滅活性，并且與商品化的米爾貝霉素A3/A4無顯著性差異，說明化合物1和2不僅有望作為米爾貝霉素A3/A4的替代殺蟲劑，還有可能通過對其結構修飾得到活性更高的新一代農用或獸用抗生素。