鹽酸小檗堿明膠微球的制備及其性能表征

楊紅艷，周中流，夏加亮

1嶺南師范學院化學化工學院；2粵西特色生物醫藥工程技術研究中心，湛江 524048

鹽酸小檗堿(berberine hydrochloride，BH)又稱為黃連素，是一種黃色結晶粉末，味道極苦，具有抗癌、抗菌、降血糖、降膽固醇、舒張血管等作用[1-3]。因其具有顯著的抑菌作用，常用來治療細菌性痢疾、胃腸炎等疾病，療效確切[4]。但其味極苦，患者依從性差，將其制成微球可改善藥物口感、掩蓋其苦味，還能減小鹽酸小檗堿對胃黏膜的刺激[5]。明膠微球以其生物可降解、低毒等優點，目前廣泛應用于藥物新劑型的研究[6]。微球制劑還具有緩釋、提高穩定性、掩味和靶向作用[7,8]。本實驗以乳化-化學交聯固化法將鹽酸小檗堿制成親水明膠微球，并優化制備工藝，進行表征分析，考察釋放性能，以期為相關制劑的研究提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司)；SPD-20A紫外檢測器(日本島津公司)；T9紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；DL-5M低速冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；BT25S電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；GWA-UP1-F超純水器(北京普析通用儀器有限責任公司)；X’pert Pro MPD X射線衍射儀(PANalytical儀器有限公司)；Nicolet6700傅里葉變換紅外光譜分析儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；STA 6000綜合熱分析儀(美國PerkinElmer公司)；XL-30掃描電子顯微鏡(荷蘭PHILIPS儀器有限公司)；WJL-602型激光粒度分析儀(上海儀電物理光學儀器有限公司)；RCZ-6C3藥物溶出度儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿(四川協力制藥有限公司，批號：C025A131109)；鹽酸小檗堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110713-201613)；明膠(生化試劑，天津市大茂化學試劑廠)；Span-80(脂肪酸山梨坦)(化學純，廣東光華化學廠有限公司)；液狀石蠟(化學純，廣州化學試劑)；異丙醇(分析純，廣東光華科技股份有限公司，批號：20171226)；25%戊二醛溶液(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，廣東光華科技股份有限公司)；KBr(光譜純，Aladdin)；超純水(自制)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 鹽酸小檗堿明膠微球的制備

稱取適量過100目篩的鹽酸小檗堿置于乳缽中，加入適量60 ℃的12%明膠水溶液研磨制成藥物明膠混懸液，再與剩余的明膠溶液混合均勻，保溫。然后用注射器將混懸液緩慢滴入一定攪拌速度的含Span-80的液體石蠟中(50 ℃恒溫)，制成穩定的W/O型乳劑。立即置于0～4 ℃冰浴降溫，攪拌10 min，加入適量25%戊二醛溶液，低速攪拌交聯固化1 h，靜置，在3 500 r/min下離心沉降，用異丙醇離心洗滌3次，抽濾，再用異丙醇洗滌至無戊二醛氣味，抽干去除殘余異丙醇，50 ℃下干燥即得鹽酸小檗堿微球。

2.2 鹽酸小檗堿含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Pgranfsil-STC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈:0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液=40∶60(以磷酸調節pH至2.5)；檢測波長：266 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：35 ℃。色譜圖見圖1。

圖1 鹽酸小檗堿HPLC色譜圖

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿對照品11.0 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液(0.11 mg/mL)。從中精密量取1.0 mL置于10 mL量瓶，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿明膠微球約0.05 g，置于25 mL量瓶中，加入6 mg/mL胰蛋白酶溶液3 mL[9]，密塞，置于40 ℃恒溫水浴鍋酶解4 h，放冷，加甲醇定容至刻度，搖勻，取1.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備

取空白明膠微球按照“2.2.3”項下的供試品溶液處理方法制備得陰性樣品溶液。

2.2.5 線性關系考察

精密量取鹽酸小檗堿對照品貯備溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，按照“2.2.1”項色譜條件，各精密吸取20 μL注入液相色譜儀，以峰面積積分值(Y)對鹽酸小檗堿溶液質量濃度(X)進行線性回歸，得線性方程Y=67 729X-24 314(R2=0.999 6)，表明鹽酸小檗堿質量濃度在11～55 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.6 精密度試驗

精密吸取對照品溶液20 μL，按“2.2.1”項色譜條件，重復進樣5次，分別測定其峰面積，得出RSD值為1.70%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩定性試驗

取新制備的供試品溶液于0、2、4、6、12、24 h，按“2.2.1”項色譜條件，進樣20 μL，測定鹽酸小檗堿的峰面積，得出RSD值為0.82%，表明樣品溶液在24 h內穩定。

2.2.8 重復性試驗

取同一批鹽酸小檗堿明膠微球，精密稱取5份，按“2.2.3”項下操作制成供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件，進樣20 μL，測定其峰面積，分別計算鹽酸小檗堿含量，并計算得出RSD值為1.29%，表明該方法重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的鹽酸小檗堿明膠微球樣品0.05 g，稱取9份，分為三組，每組分別加入相當于鹽酸小檗堿含量80%、100%、120%的對照品，按“2.2.3”項方法制備，按“2.2.1”項色譜條件測定，計算加樣回收率，其鹽酸小檗堿的平均加樣回收率為101.33%，RSD值為2.08%，表明該法準確度高。

2.2.10 檢測限與定量限

依照ICH指導原則Q2(R1)中信噪比(S/N)法分別確定鹽酸小檗堿的檢測限與定量限。取濃度為11 μg/mL對照品溶液加甲醇逐級稀釋，在建立的色譜條件下進樣分析，按S/N≥3確定檢測限濃度，測得檢測限為0.011 μg/mL；按S/N≥10確定定量限濃度，測得定量限為0.055 μg/mL。

2.3 包封率與載藥量及粒徑測定

2.3.1 包封率與載藥量測定

取適量鹽酸小檗堿明膠微球，按照“2.2.3”項制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，并依據以下公式計算載藥量和包封率。

2.3.2 粒徑測定

將制備得到的鹽酸小檗堿明膠微球，于研缽中研磨后過100目篩，取適量微球，分散于超純水中，用WJL-602型激光粒度分析儀測定其粒徑。

2.4 Box-Behnken效應面法優化處方設計

2.4.1 試驗設計

根據預實驗(單因素試驗)結果，選取對鹽酸小檗明膠微球性質影響較為顯著的3個因素，即明膠質量分數(A)、投藥量(%，藥物在藥膠中的質量分數)(B)、油水比值(C)，以包封率(Y1)、載藥量(Y2)作為評價指標，采用Box-Behnken效應面法進行優化，其因素水平見表1，試驗安排及結果見表2。

表1 Box-Behnken試驗因素水平表

表2 Box-Behnken試驗方案及結果

2.4.2 模型擬合及方差分析結果

通過Design-Expert 8.0.6軟件進行擬合，得回歸方程為：Y1=-72.786+4.531A+2.453B+27.614C-0.365AB+0.374AC-0.309BC+0.164A2+0.088B2-2.572C2(R2=0.864 0，P=0.023 5)；Y2=-39.246+2.772A+1.789B+4.728C-0.017 8AB-0.098 8AC+0.014 5BC-0.067 7A2-0.020 0B2-0.391C2(R2=0.983 2，P<0.000 1)。由二項式擬合方程可知，所得模型相關性好，模型P值均小于0.05，且失擬項P值均大于0.05，說明建立的模型擬合度較高，能用于分析和預測響應值。由表3、表4回歸系數顯著性檢驗結果可知，對包封率Y1的影響大小順序如下：A>B>C；對載藥量Y2的影響大小順序如下：B>A>C。一次項A、B對Y1、Y2均有顯著影響(P<0.01)，除模型Y1中AB交互作用P<0.05有顯著影響外，其余因素間的交互作用P值均大于0.05，說明交互作用均不顯著。

表3 包封率回歸模型方差分析結果

表4 載藥量回歸模型方差分析結果

2.4.3 效應面優化及工藝驗證

繪制較顯著的2個因素(A、B)對包封率和載藥量的三維響應面圖見圖2、3。通過Design-Expert8.0.6軟件進行處方的優化組合，得包封率和載藥量的最優處方均為：明膠質量分數為12%，投藥量為25%，油水比值為4.79；包封率預測值為69.71%，載藥量預測值為20.90%。按最優處方制備3批鹽酸小檗堿明膠微球，測定其載藥量、包封率、粒徑，結果見表5。按誤差=(預測值-平均值)/預測值×100%，將實測值與模型預測值對比，其包封率與載藥量的誤差分別為4.45%、2.87%，均小于5%，說明所建模型具有較好的預測能力，優化工藝處方穩定可靠。

圖2 明膠質量分數和投藥量對包封率的響應面圖

圖3 明膠質量分數和投藥量對載藥量的響應面圖

表5 驗證試驗結果(n=3)

2.5 鹽酸小檗堿明膠微球性能表征

2.5.1 掃描電子顯微鏡(SEM)

取適量明膠微球置于燒杯中，加入適量的乙醇，超聲分散10 min后用滴管均勻滴加到銅臺雙面膠帶上，自然揮干后噴金，采用掃描電子顯微鏡觀察，結果見圖4。由圖可知，微球形態圓整，表面相對光滑，大小均勻，有稍許黏連現象。

圖4 鹽酸小檗堿明膠微球掃描電鏡圖

2.5.2 紅外光譜分析(FT-IR)

將鹽酸小檗堿、空白明膠微球、載藥明膠微球、物理混合物分別置于研缽中研磨，KBr壓片處理后，采用傅里葉變換紅外光譜分析儀，在4 000～400 cm-1掃描范圍分別進行紅外光譜分析，結果見圖5。由圖5D曲線可知，鹽酸小檗堿在1 389 cm-1和1 505 cm-1處具有苯環的特征峰，在1 231 cm-1處具有C-O-C的特征峰[10，11]；由圖5A曲線可知，明膠在2 959、2 925和2 855 cm-1處具有氨基的特征峰；由圖5B曲線可知，物理混合物可見明顯的鹽酸小檗堿、空白明膠微球特征峰疊加，說明物理混合物中鹽酸小檗堿以原型藥物形式存在；而由圖5C曲線可見，鹽酸小檗堿的特征峰明顯消失，只存在明膠的特征峰，說明制備成鹽酸小檗堿明膠微球后，藥物進入微球內部，制備過程中藥物與載體材料之間未發生明顯的相互作用。

圖5 鹽酸小檗堿明膠微球紅外分析圖譜

2.5.3 X射線-粉末衍射分析(XRD)

由鹽酸小檗堿、空白明膠微球、物理混合物和鹽酸小檗堿明膠微球的XRD圖(見圖6)可見，鹽酸小檗堿在9.19°、25.47°和26.35°處有尖銳、狹窄的衍射峰[12,13]；空白明膠微球只在20°附近有一個較寬的特征峰；物理混合物的XRD圖中明顯出現了鹽酸小檗堿的特征衍射峰，說明物理混合物中鹽酸小檗堿是以原晶型形式存在的；而載藥明膠微球的XRD圖中除了在25.47°處有鹽酸小檗堿的特征衍射峰外，其余均被明膠微球特征圖譜掩蓋，說明鹽酸小檗堿制備成明膠微球后大部分分散在微球內部，少量分散粘在微球表面。

圖6 鹽酸小檗堿明膠微球X射線衍射圖譜

2.5.4 差示掃描量熱法及熱重分析(DSC&TG)

分別取鹽酸小檗堿、空白明膠微球、物理混合物和鹽酸小檗明膠堿微球少量，于STA 6000綜合熱分析儀在條件為10 ℃/min，氮氣氣氛中進行分析，結果見圖7。由圖7A的TG曲線及DSC曲線可知，鹽酸小檗堿在40～120 ℃溫度范圍內存在兩個失重區域，其中40～70 ℃為游離水的失重區域，70～120 ℃為結晶水的失重區域；在170～240 ℃溫度范圍內也存在兩個失重區域，為鹽酸小檗堿的晶形熔融分解而失重，由DSC曲線可推測鹽酸小檗堿的熔點為190 ℃及210 ℃，因此該鹽酸小檗堿原料藥為熔點190 ℃和210 ℃兩種晶形的混合物，其以190 ℃晶形為主[14]。由圖7C物理混合物的DSC曲線可知，同時具有鹽酸小檗堿190 ℃、210 ℃熔融峰和空白微球的230 ℃熔融峰，說明物理混合物中鹽酸小檗堿是以原晶型的形式存在的。由圖7D鹽酸小檗堿微球的DSC曲線可知，鹽酸小檗堿在190 ℃的晶型熔融峰明顯消失，只在210 ℃有微弱的晶型熔融峰，結合X衍射分析結果可以判斷，鹽酸小檗堿在明膠微球中主要是無定型狀態。

圖7 DSC和TG分析曲線

2.5.5 體外釋放考察[15]

參照2020年版《中國藥典》四部0931溶出度與釋放度測定法第二法(槳法)。精密稱取適量鹽酸小檗堿微球分別置于500 mL pH值為2.5和7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，于溫度(37士0.5)℃，轉速100 r/min的條件下，分別在0.5、1、2、4、6、8、10、12 h取樣5 mL，同時補充相同體積新鮮介質，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，計算累積釋放率，繪制累積釋藥曲線見圖8，并分別以零級、一級、Higuchi模型進行釋藥曲線擬合，結果見表6、表7。由模型擬合結果可知，鹽酸小檗堿及明膠微球在兩種釋放介質中均與一級動力學模型擬合度高，其次是Higuchi模型；由Higuchi模型相關系數可知，明膠微球的藥物釋放Higuchi模型擬合度均高于游離藥物，且在酸性條件下擬合度更好，說明鹽酸小檗堿藥物的釋放主要受溶出的影響，而微球中藥物的釋放同時受Fick擴散的影響，且在酸性條件下受Fick擴散影響更大，再結合圖8可知，鹽酸小檗堿明膠微球在酸性條件下(pH2.5)的磷酸鹽緩沖溶液中釋放較緩；在兩種pH條件下鹽酸小檗堿0.5 h藥物釋放達40%左右，4 h后藥物釋放達90%以上，而鹽酸小檗堿明膠微球0.5 h藥物釋放小于20%，12 h藥物累積釋放可達90%以上，說明明膠微球對鹽酸小檗堿具有一定的緩釋作用。

圖8 鹽酸小檗堿明膠微球體外釋藥曲線

表6 在pH2.5的磷酸鹽緩沖溶液中的釋藥曲線擬合結果(n=3)

表7 在pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中的釋藥曲線擬合結果(n=3)

3 討論與結論

本研究采用乳化-化學交聯法制備鹽酸小檗堿微球，其載藥量為19.97%，包封率為67.71%，體外釋藥顯示藥物釋放較為緩慢。DSC、XRD和紅外光譜分析顯示，微球中鹽酸小檗堿以無定型形式存在，但微球表面含有少量鹽酸小檗堿。掃描電鏡觀察微球外貌形態發現微球圓整光滑，大小均勻但有黏連現象，可能與干燥方法、干燥溫度、干燥速度等因素有關，下一步研究將進行干燥條件考察，以改善明膠微球的外觀形態，提高微球質量。

在制備過程中選取合適的乳化劑、交聯劑對明膠微球的圓整度、大小等有較大影響。在預實驗中發現span-80作為乳化劑乳化效果優于Twen-80及混合乳化劑，可得到圓整度較好的微球，故選用span-80為乳化劑。明膠微球常用的交聯固化劑有甲醛和戊二醛，通過預實驗考察發現戊二醛為交聯固化劑得到的微球粒徑小且圓整，而甲醛使制備的微球有較大黏連，圓整度差；且用戊二醛為固化劑不要調節pH值，可在中性條件下反應，操作簡便，故選擇戊二醛為交聯固化劑。

采用乳化-化學交聯法制備鹽酸小檗堿明膠微球，方法簡單可行，只需一種囊材，明膠可生物降解、低毒、價廉易得，制備得到的鹽酸小檗堿明膠微球載藥量大，包封率較高，穩定性好，具有較好的應用前景。