槲皮素對多囊卵巢綜合征大鼠卵巢顆粒細胞增殖與凋亡的影響研究

江雪娟 陳曉菲 俞佳 王晨曄 胡慧敏 丁彩飛

浙江省中西醫結合醫院 杭州 310005

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是育齡女性常見的生殖內分泌及代謝疾病，臨床多表現為排卵障礙、肥胖、胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、脂代謝異常等[1]。IR是上述疾病的中心環節，IR導致的高胰島素血癥增加了患者罹患2型糖尿病、肥胖以及心血管疾病的風險[2]。目前，PCOS的發病原因及機制尚未完全闡明，給臨床診斷和治療帶來較大阻礙。

槲皮素（quercetin，Q）生物學活性較高且藥理作用廣泛，具有降糖、降脂、抗氧化損傷等作用[3]。晚期糖基化終末產物/晚期糖基化終末產物受體（advanced glycation end products/receptor of advanced glycation end products，AGEs/RAGE）信號通路是體內糖代謝信號通路之一，不僅與IR密切相關，同時也對細胞的生長、凋亡具有顯著的調控作用。既往研究提出，槲皮素可以改善PCOS大鼠氧化應激狀態[4]，但具體機制尚需進一步驗證。因此本研究以此作為切入點，探究槲皮素是否通過調控AGEs/RAGE 信號通路改善PCOS大鼠IR和排卵障礙，明確其治療PCOS的分子機制，對今后研究PCOS伴IR提供一種新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑 四甲基偶氮唑鹽[3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]試劑盒購于上海BBI Life Sciences公司（批號：E606334-0500）；大鼠孕激素/孕酮（proges terone/progesterone，PROG）酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、大鼠雌二醇（estradiol，E2）ELISA試劑盒均購于江蘇酶免實業有限公司（批號：MM-0551R2、MM-0575R2）；大鼠黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、雄激素（testosterone，T）ELISA試劑盒均購于上海酶聯生物科技有限公司（批號：ml002860、ml059506）；細胞凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司（批號：556547）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司（批號：S0033S）；逆轉錄試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司（批號：CW2569）；AGEs多克隆抗體購于北京Bioss公司（批號：BS-1158R）；RAGE、細胞外信號調節蛋白激酶1/2（extracellular singnal regulated protein kinases，ERK1/2）、磷酸化細胞外信號調節蛋白激酶1/2（phospho-extracellular singnal regulated protein kinases 1/2，phospho-ERK1/2）、p38有絲分裂原蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）、磷酸化p38有絲分裂原蛋白激酶（p38 phospho-mitogen-activated protein kinase，phospho-p38 MAPK）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體均購于江蘇Affinity公司（批號：AF5309、AF0155、AF1015、BF8015、AF4001、AF7021）。

1.2 實驗儀器 TS-2倒置熒光顯微鏡購于日本尼康公司；C6流式細胞儀購于美國BD公司；CFX Connect實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）儀為BIO RAD公司產品。

1.3 實驗動物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雌性SD大鼠30只，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005]，21～23 d齡，體質量（60±10）g，飼養于杭州鷹旸生物科技有限公司動物中心[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2020-0024]，本研究動物倫理已獲得杭州鷹旸生物科技有限公司動物中心許可（倫理批準號：EYOUNG-20201230-03）。

1.4 伴IR的PCOS大鼠模型的建立 隨機選擇10只大鼠作為正常對照組，20只作為模型組。大鼠飼喂普通飼料1周后，PCOS模型組每日飼喂高脂飼料并以1%羧甲基纖維素（carboxyl methyl cellulose，CMC）溶解的來曲唑液0.4 mL灌胃，劑量1 mg/（kg·d），對照組灌胃同體積1%CMC，連續灌胃23 d，模型建立參照Sun等[5]的研究。自23 d起進行陰道涂片觀察，以陰道涂片提示失去完整動情周期作為PCOS大鼠建模成功的標志。

1.5 方法

1.5.1 卵巢顆粒細胞的提取、培養及鑒定 PCOS模型大鼠腹腔注射孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG），50 U/只，2 d 后脫頸處死。紫外照射后分離雙側卵巢，于滅菌0.9%氯化鈉溶液中保存。剔除卵巢表面包膜及脂肪組織，再次以0.9%氯化鈉溶液進行清洗，最后放入達爾伯克改良伊格爾培養基/F12（Dulbecco's Modified Eagle Media/F12，DMEM/F12）中。利用空針針頭刺破卵泡，將釋放的細胞置于培養基中，并用巴氏管吹打，過篩。收集細胞懸液，取20 mL單細胞懸液進行細胞計數，調整細胞濃度為2×106/mL，加入適量含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養。光鏡觀察，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色鑒定，觀察卵巢顆粒細胞的形態及核質分布。

1.5.2 實驗分組及藥物干預 細胞培養2 d后，將來自PCOS大鼠的顆粒細胞隨機分成6組，PCOS組、PCOS+4-氯-N-環己基-N-（苯基甲基）苯甲酰胺[（N-benzyl-4-chloro-N-cyclohexylbenzamide，FZ）500 nmol·L-1]組、PCOS+L-Q（槲皮素低劑量0.5 μg·mL-1）組、PCOS+H-Q（槲皮素高劑量1 μg·mL-1）組、PCOS+H-Q+FZ（槲皮素高劑量1 μg·mL-1+FZ 500 nmol·L-1）組、PCOS+二甲雙胍（metformin hydrochloride，MH）組，MH用藥劑量參考Huang等[6]的實驗研究，另取正常大鼠的顆粒細胞作為對照組。阻斷劑組以FZ預處理30 min，各組培養2 d后進行相關檢測。

1.5.3 MTT檢測細胞活力

1.5.3.1 MTT檢測槲皮素對正常顆粒細胞活力的影響 細胞經過胰酶消化后，按每孔2×103個的數量接種于96孔板，每孔200 mL，設置5個復孔。給予不同濃度槲皮素（0、0.01、0.1、1、10 μg·mL-1）處理24、48 h，利用MTT法測定細胞活力。

1.5.3.2 MTT檢測不同藥物處理對PCOS顆粒細胞活力的影響 細胞經胰酶消化后，按每孔2×103個的數量接種于96孔板，每孔200 mL，設置5個復孔。各組別參照1.5.2中給藥劑量并設對照組處理24、48 h，利用MTT法測定細胞活力。

1.5.4 ELISA檢測激素含量 按照ELISA試劑盒操作說明，測定細胞上清液中E2、P、FSH、LH和T的含量。

1.5.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 將細胞以每孔1.2×106個的數量接種于6孔板中，按照分組給藥處理24 h后，調整細胞濃度為1×106個/mL。依次加入500 μL結合緩沖液，棄去上清液，再次加入100 μL結合緩沖液后混勻，分別加入異硫氰酸熒光素標記磷脂結合蛋白（Annexin-fluorescein isothiocyanate isomer，AnnexinⅤ-FITC）5 μL與碘化丙啶（propidium iodide，PI）10 μL，避光孵育后再次加入400 μL結合緩沖液，上機檢測細胞凋亡。

1.5.6 ROS活性檢測 取對數生長期細胞，消化后制成1×105/mL細胞懸液，加入24孔板中，然后加入2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯50 μL，37 ℃下避光孵育20 min，洗滌后倒置顯微鏡觀察并拍攝圖像。

1.5.7 Real-time qPCR檢測RAGE、Bax、Bcl-2及炎性介質HMGB1的mRNA表達 收集細胞，提取RNA，配置反應體系進行逆轉錄及Real-time qPCR反應，檢測RAGE、Bax、Bcl-2及炎性介質HMGB1的mRNA表達。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5.8 免疫印跡法檢測AGEs、RAGE、MAPK、ERK蛋白水平 收集細胞，裂解后提取總蛋白，電泳和轉膜后，加入一抗、二抗孵育，化學發光顯影，檢測AGEs、RAGE、MAPK、ERK蛋白水平。

1.6 統計學分析 采用SPSS 16.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以表示，不同組間兩兩比較采用單因素方差分析，同組間采用SNK分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卵巢顆粒細胞的鑒定結果 光鏡下大鼠卵巢顆粒細胞生長旺盛，形態多呈梭形或多邊形。HE染色顯示，貼壁細胞邊緣清晰、形態完整，核染成藍紫色，胞質為淡粉色。見圖1。

圖1 卵巢顆粒細胞的鑒定結果Fig.1 Identification results of ovarian granulosa cells

2.2 各組細胞活力比較 對于正常大鼠顆粒細胞，給予不同濃度的槲皮素處理后，僅10 μg·mL-1組細胞活性顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），低劑量組差異無統計學意義（P＞0.05）。而在PCOS大鼠顆粒細胞中，與對照組比較，PCOS組細胞活性顯著降低（P＜0.01）。與PCOS組比較，藥物作用24 h后，PCOS+H-Q+FZ組和PCOS+MH組細胞活性顯著升高（P＜0.01）；藥物作用48 h后，PCOS+FZ組、PCOS+H-Q組、PCOS+H-Q+FZ組和PCOS+MH組細胞活性均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組細胞活力比較Fig.2 Comparison of cell viability in each group

2.3 各組細胞中激素含量比較 與PCOS組比較，PCOS+FZ 組、PCOS+H-Q 組、PCOS+H-Q+FZ 組 和PCOS+MH組細胞中E2、LH、T的含量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 各組細胞E2、P、FSH、LH、T含量比較Tab.2 Comparison of contents of E2，P，FSH，LH and T in each group（）

表2 各組細胞E2、P、FSH、LH、T含量比較Tab.2 Comparison of contents of E2，P，FSH，LH and T in each group（）

注：與PCOS組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。Note: Compared with PCOS group，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01.

2.4 各組細胞凋亡情況比較 與PCOS 組比較，PCOS+FZ 組、PCOS+H-Q 組、PCOS+H-Q+FZ 組 和PCOS+MH組卵巢顆粒細胞凋亡率均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組細胞凋亡情況比較Fig.3 Comparison of cell apoptosis in each group

2.5 各組卵巢顆粒細胞中ROS活性比較 與PCOS組比較，PCOS+FZ組、PCOS+H-Q組、PCOS+H-Q+FZ組和PCOS+MH組卵巢顆粒細胞中ROS的熒光強度顯著減弱（P＜0.05，P＜0.01），說明細胞中ROS活性顯著降低。見圖4。

圖4 各組卵巢顆粒細胞中ROS熒光表達情況Fig.4 ROS fluorescence expression in ovarian granulosa cells of each group

2.6 各組細胞RAGE、Bax、Bcl-2及HMGB1的mRNA表達比較 與PCOS組比較，PCOS+H-Q組、PCOS+H-Q+FZ 組、PCOS+MH 組中RAGE、HMGB1 及Bax mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），Bcl-2 mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01）。見圖5。

圖5 各組細胞RAGE、Bax、Bcl-2及HMGB1的mRNA表達比較Fig.5 Comparison of mRNA expression of RAGE，Bax，Bcl-2 and HMGB1 in each group

2.7 各組細胞AGEs/RAGE及ERK/MAPK信號通路相關蛋白表達比較 與PCOS 組比較，PCOS+FZ 組、PCOS+H-Q、PCOS+H-Q+FZ組和PCOS+MH組AGEs和RAGE 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），PCOS+H-Q組、PCOS+H-Q+FZ組和PCOS+MH組中的p-ERK和p-p38MAPK 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖6。

圖6 各組細胞AGEs、RAGE、p-ERK、ERK、p-p38MAPK、p38MAPK蛋白表達比較Fig.6 Comparison of protein expressions of AGEs，RAGE，p-ERK，ERK，p-p38MAPK and p38MAPK in each group

3 討論

PCOS屬于生殖障礙與代謝紊亂并存的疾病，臨床治療雖然可使患者獲得一定質量的卵母細胞，但是卻無法獲得較多高質量的成熟卵母細胞[7-8]，因此積極深入探究其發病機制是如今PCOS研究的關鍵問題。本研究首先通過MTT法檢測細胞活力，以確定槲皮素的合適干預濃度。以連續灌胃來曲唑并配合高脂飼料的方式，建立PCOS大鼠模型，并將陰道涂片失去完整動情周期作為模型制備成功的標準。T增高作為本病的典型內分泌改變，與月經稀發、無排卵、不孕等密切相關。本研究提示，槲皮素干預后性激素水平也得到改善，提示槲皮素在改變PCOS大鼠異常性激素水平方面有較好的潛能，并且高劑量組改善效果更為明顯。Jahan等[9]研究發現，槲皮素處理22 d后，PCOS大鼠卵巢直徑以及囊性卵泡的直徑均顯著減小，并且T、LH含量降低，與本文結論一致。

RAGE是一種具有重要功能的細胞表面受體，當其與配體AGEs結合后，能夠引起下游多條信號通路的改變，引起一系列生物學反應，加快機體細胞的凋亡[10]。FZ是一種近期發現的AGEs/RAGE通路小分子阻斷劑，在多項研究中已有運用。本研究運用槲皮素及AGEs/RAGE通路阻斷劑對PCOS大鼠的卵巢顆粒細胞進行干預，從而能夠更明確地探究槲皮素對AGEs/RAGE通路的作用機制。在陽性藥物選擇上，針對IR，將臨床應用最廣泛的二甲雙胍列入實驗分組中[11]，從而能夠更好地評價槲皮素的作用。細胞凋亡實驗觀察到PCOS組細胞凋亡率最高，而加入阻斷劑及高劑量槲皮素處理后，細胞凋亡率顯著減低，與PCOS+MH組結果趨同，并且其中僅加入阻斷劑和僅進行高劑量藥物處理組均能夠顯著降低細胞凋亡，可以推測槲皮素可能發揮與阻斷劑相同的作用，阻斷AGEs/RAGE通路活性，從而保護細胞。

HMGB1是一種新發現的炎癥因子，可介導IR，從而誘導卵巢顆粒細胞的凋亡[12]。與細胞凋亡關系最密切的當屬Bcl-2家族，其中以Bcl-2和Bax最具典型。Bcl-2是一種癌基因，能夠作為潛在的抑制因子調節細胞凋亡；而Bax與之相反，是一種凋亡促進因子[13]。本研究中，槲皮素高劑量組及阻斷劑加高劑量組HMGB1及Bax的mRNA表達水平顯著降低，Bcl-2的mRNA表達水平顯著升高，推測槲皮素可抑制細胞凋亡。另外，加入阻斷劑及槲皮素處理均可見卵巢顆粒細胞中ROS的熒光強度顯著減弱，提示ROS活性降低。申超[10]在研究中指出，ROS是激活促炎反應的重要上游介質，因此可推斷槲皮素或許可以降低機體的炎癥反應，起到細胞保護作用，這一作用有待后續實驗進一步驗證。

MAPK屬于絲氨酸蛋白激酶，在磷酸化過程中可促進其他胞質蛋白磷酸化，ERK是MAPK家族成員，能夠在細胞增殖、分化過程中發揮重要的調控作用[14]。ERK表達量升高時會導致胰島素信號傳導通路受到破壞，從而增強IR，因此降低EPK表達，升高p-ERK表達將能夠減輕細胞損傷。研究指出，p38MAPK與IR的形成密切相關，p-p38 MAPK含量與細胞的增殖密切相關，但有關p-p38 MAPK、p-ERK與AGEs/RAGE通路的研究卻較少見于報道[15-16]。本研究發現，加入槲皮素及通路阻斷劑后，AGEs和RAGE的蛋白表達水平顯著降低，表明AGEs/RAGE通路活性受到抑制；而p-ERK和p-p38 MAPK的蛋白的表達水平均顯著升高，提示AGEs/RAGE通路活性受到抑制時，細胞增殖調控因子含量升高，從而起到細胞保護作用。

綜上所述，本研究發現槲皮素能夠抑制PCOS模型大鼠中卵巢顆粒細胞凋亡，促進細胞增殖，其作用主要是通過抑制AGEs/RAGE通路活性實現的。