中藥調節DNA高甲基化用藥規律的網絡藥理學及數據挖掘研究*

郭宵飛 李智飄 李靜靜 張 平△

（1.中國中醫科學院望京醫院，北京 100102；2.北京中醫藥大學，北京 102400）

DNA甲基化是研究最深入的表觀遺傳修飾之一。它在染色質結構、抑制內源性寄生序列活性和穩定抑制基因表達中起關鍵作用，對基于潛在基因序列的基因活動而言，不同基因組區域的DNA甲基化可能會產生不同的影響［1-2］。研究表明，異常的DNA甲基化與腫瘤的發生發展有著密切的聯系。低水平及高水平的甲基化有著不同的作用，前者可激活基因的表達導致癌基因表達上調或導致染色體的不穩定性增加，后者可導致部分抑癌基因沉默，增加腫瘤發生的風險［3］。其中DNA高水平甲基化是近年來的研究熱點。越來越多的研究發現，甲基化的發生大多數是在正常衰老過程中以一種程序化的方式產生的，這會提高腫瘤發生的危險性［4］。DNA甲基化這一進程是可逆的［5］，因此針對DNA甲基化進行治療以降低腫瘤的發生率、改善腫瘤患者的預后等成為腫瘤治療的新思路。中藥復方的治療具有多靶點、多層次、副作用少等特點。已有研究表明，中藥在去DNA甲基化方面有著顯著的效果，如KUMAR U等［6］研究發現，姜黃素可以影響DNA甲基轉移酶3b的轉錄水平，調控乳腺癌細胞DNA甲基化水平，從而抑制癌細胞生長。然而相關的報道較少，缺乏進一步的研究。本研究基于中藥系統網絡藥理學研究方法，將中藥、成分、靶點等層次的信息進行整合篩選，從而展現去DNA甲基化的藥物、成分、靶點之間的關系，為進一步探索中醫藥調節DNA甲基化水平的理論研究、新藥研發以及臨床用藥提供思路和理論依據。

1 資料與方法

1.1 DNA高甲基化相關作用靶點收集 登錄Gene-Cards（http：//www.genecards.org）［7］、OMIM（https：//omim.org）［8］、GenCLip 3（http：//ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php）［9］等數據庫，以“DNA hypermethylation”為關鍵詞進行檢索，獲得與DNA高甲基化相關靶點，并采用蛋白數據庫 UniProt（https：//www.uniprot.org/）［10］匹配各個靶點的全稱。

1.2 篩選候選化合物及構建化合物-靶點網絡 運用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com）［11］收集作用于DNA高甲基化相關靶點的化合物，并以DL≥0.18為條件進行篩選，獲得DNA高甲基化相關化合物的名稱、DL值以及PubChem CID等信息。將潛在靶點、候選化合物導入Cytoscape 3.7.1軟件構建靶點-化合物網絡。

1.3 獲取中藥及靶點-化合物-中藥網絡構建 通過TCMSP收集含有篩選得到的候選化合物的中藥，根據2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）［12］、《中藥學》［13］進行篩選，并進行中藥名稱規范，得到候選中藥。最后利用Cytoscape軟件構建靶點-化合物-中藥網絡，根據網絡中各個節點的拓撲學參數篩選出核心節點。

1.4 中藥數據整理以及頻數分析 根據2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）、《中藥學》匹配所獲得候選中藥的性、味及歸經等信息，利用Excel軟件進行頻數分析。

2 結果

2.1 所獲取的作用靶點結果 見表1。通過檢索GeneCards、OMIM、GenCLip 3等數據庫共收集與DNA高甲基化相關的靶點189個，其中在TCMSP數據庫中能匹配到的化合物的靶點有47個，可關聯到化合物DL≥0.18的靶點有35個，將這35個靶點定義為潛在靶點。

表1 化合物作用于DNA高甲基化的潛在靶點

2.2 候選化合物及構建靶點-化合物網絡 見圖1，表2。通過TCMSP檢索得到的潛在靶點，共獲得1 188個相關化合物。將潛在靶點與候選化合物構建靶點-化合物網絡，該網絡由1 223個節點與1 509條邊構成。網絡總節點的度值越大，提示該節點在網絡中的樞紐性越強，調控作用越大。網絡中，度值最高的前3位的靶點為ESR1、PGR、CHEK1，分別與732、372、236個化合物相關；度值最高的前4位的化合物為（-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯［（-）-epigallocatechin-3-gallate）］、槲皮素（quercetin）、金雀異黃酮（genistein）、木樨草素（luteolin），分別與15、15、9、8個靶點相關。選取度值≥2的候選化合物與其關聯的潛在靶點構建靶點-化合物網絡，圖中菱形節點表示靶點，六角多邊形節點代表化合物，各節點的大小與度值呈正相關關系。

表2 中藥調節DNA高甲基化的潛在核心化合物（度值＞20）

圖1 DNA高甲基化相關靶點-化合物網絡

2.3 獲取的相關中藥及構建的靶點-化合物-中藥網絡 見圖2，圖3。在TCMSP數據庫中匹配所獲的1 188種候選化合物，共獲得470種中藥，通過《中藥學》及2020年版中藥藥典篩選后，共收集到408味中藥。構建化合物-中藥網絡，網絡中共含1 596個節點，3 425條邊。其中度值最高的前5味中藥為甘草、丹參、沙棘、枸杞子、桑白皮，分別含有96、44、35、34、34個候選化合物。以候選化合物為橋接收集各個中藥可作用的靶點，包含靶點數目最多的前4味中藥為枇杷葉、白果、女貞子、余甘子，預測此4味中藥為干預DNA高甲基化的核心。選取度值≥4的候選化合物及度值≥10的中藥與其關聯的潛在靶點構建靶點-化合物-中藥網絡。圖中方形的節點代表中藥，菱形的節點表示靶點，六角多邊形的節點代表化合物，節點大小與度值高低呈正相關。

圖2 相關中藥的關聯候選化合物及作用靶點（前15位）

圖3 靶點-化合物-中藥網絡

2.4 分子對接結果 見表3，圖4。將高度值靶點PGR（PDB ID：1SQN）、CHEK1（PDB ID：2YEX）、CDKN1A（PDB ID：5E0U）、BCL2（PDB ID：6GL8）、ESR1（PDB ID：7BAA）與高度值化合物槲皮素、西托糖苷、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇分別進行分子對接。結合能＜-5.0 kcal/mol表示靶點與化合物有較好的結合活性。對接結果顯示，各靶點與化合物的對接結合能均＜-5.0 Kcal/mol，提示其結合活性良好。其中，β-谷甾醇與PGR的結合能最佳，為-9.3 kcal/mol，基本驗證了靶點與化合物之間有著密切關聯。將4個結合能小于-8.5 Kcal/mol的對接結果進行展示。

表3 核心潛在靶點與候選化合物分子對接結果（kcal/mol）

圖4 部分核心潛在靶點與候選化合物分子對接示意圖

2.5 候選中藥的性味與歸經統計結果 見表4～表6。匹配所獲得的408種中藥的四氣、五味及歸經信息并利用Excel進行頻數統計，結果顯示，可干預DNA高甲基化的中藥藥味以苦、辛、甘為主，藥性以溫、寒居多，主要歸肝、肺二經。

表4 調節DNA高甲基化中藥的藥性分布

表5 調節DNA高甲基化中藥的藥味分布

表6 調節DNA高甲基化中藥的歸經分布

3 討論

DNA甲基化是影響基因活動的主要表觀遺傳因素之一。DNA甲基化大多數發生在CpG位點之前的胞嘧啶或鳥嘌呤核苷酸上，不同區域的DNA甲基化可能對基因活動產生不同的影響［1］。DNA高甲基化對于癌癥的發生發展有著一定的影響，有研究發現減少小鼠模型中的甲基化也被證明可以在特定情況下預防癌癥形成。另外，眾多研究發現基因高甲基化與腫瘤治療反應差有關［14］。隨著DNA甲基化作為新的癌癥篩查指標以及治療作用靶點的廣泛應用，中藥干預DNA高甲基化的研究開始進入科研人員及臨床醫師的視線，探索可干預DNA高甲基化的中藥單藥或復方對臨床治療和新藥的研發具有重要意義。本次研究運用網絡藥理學的方法，基于多個數據庫，以DNA高甲基化相關靶點作為切入點，匹配出相關的化合物及中藥，構建靶點-化合物-中藥網絡，對中藥干預DNA高甲基化的物質基礎以及用藥規律進行了較為系統的分析預測。

根據靶點-化合物網絡，度值最高的化合物有β-谷甾醇、槲皮素、西托糖苷、豆甾醇、山柰酚等。槲皮素是黃酮類化合物中黃酮醇類的重要黃酮類化合物之一，既往研究表明，槲皮素具有通過表觀遺傳控制機制發揮部分抗癌作用的能力，它能以濃度依賴的方式抑制部分DNA甲基化［15］。Tan S等通過研究證明槲皮素可以通過誘導CDKN2A基因啟動子去甲基化并在80 mM濃度下增強基因表達從而抑制人結腸癌細胞的生長［16］。山柰酚抗腫瘤活性的假設作用機制包括阻斷細胞周期進程、誘導凋亡、抑制環氧化酶-2等［17］。調控DNA甲基化也是其作用機制之一。Wei Qiu等通過使用山柰酚治療膀胱癌裸鼠發現山柰酚調節了膀胱癌中的DNA甲基化，誘導了多個與基因相關的差異DNA甲基化位置，并觀察到山柰酚特異性抑制DNMT3B的蛋白質水平，而不改變DNMT1或DNMT3A的表達［18］。槲皮素及山柰酚都是黃酮類化合物，兩者存在于許多水果和蔬菜中，可為DNA高甲基化的食療提供方向和理論依據。

通過篩選所獲得的中藥中，干預DNA甲基化靶點數目最多的前4味中藥為枇杷葉、白果、女貞子、余甘子。枇杷葉、白果、女貞子、余甘子均含有黃酮類成分，黃酮類化合物中擁有一個黃烷核，研究發現，這種結構通過抑制DNA甲基轉移酶來抑制DNA甲基化［19］，這或許是4味中藥干預DNA高甲基化的機制之一。有研究表明，女貞子表現出對p16基因表達的促進作用以及去甲基化作用，從而抑制腫瘤細胞的增殖［20］。其余中藥干預DNA高甲基化的相關報道較少，有待進一步研究。

根據頻數分析顯示，干預DNA高甲基化的中藥藥味以苦、辛、甘為主，藥性以溫、寒居多。其主要歸經為肝、肺二經，臟病多虛，故以甘味補之。辛味能散能行，苦味能瀉能燥，二者一通一降，開泄并用，可行氣、去熱、化痰，加以甘味防止疏泄太過。肝主疏泄、主藏血，主升主動，肺主氣，主行水，朝百脈，二者一升一降，推動全身氣血運行。DNA高甲基化以抑制抑癌基因的激活為機制之一，肝肺推動氣血的運行或許是調控這一機制的重要方式。臨床用藥應可以行氣活血、補益和中、祛寒清熱為主，疏肝理肺。

隨著人們對于DNA甲基化研究的進展，以DNA甲基化為靶點的治療方法正不斷被提出。中藥治療疾病有著多靶點、多通路并且耐藥性低的特點，在干預DNA高甲基化方面有著獨特優勢，但目前關于中藥對DNA去甲基化作用的研究多局限于中藥提取物，難以發揮中醫藥復方整體治療的特點。本研究通過網絡藥理學的方法，以DNA高甲基化相關靶點為切入點，系統探討了中藥干預DNA高甲基化的物質基礎及用藥規律，為中藥干預DNA高甲基化的研究以及臨床用藥提供了一定的借鑒。本研究的數據主要從網絡數據庫收錄獲得，借助網絡構建的方法，只能顯示靶點、化合物、中藥之間的關系數量，未能兼顧不同人群、腫瘤類型等因素所帶來的影響，具有一定局限性，故研究結果仍需進一步實驗驗證。