調理中焦氣機法對膿毒癥大鼠腸道屏障損傷及炎癥因子的影響*

李國臣 王為為 田正云 謝 娜 魏久翔 郝 浩 范開亮 孔 立△

（1.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250011；2.山東中醫藥大學，山東 濟南 250014）

膿毒癥是因感染導致的危及生命的器官功能障礙［1-2］，病死率高達29%～38%［3-4］。胃腸道是膿毒癥發病早期最易累及的器官之一，是“應激反應的中心”，是“多器官功能障礙（MODS）的發動機”，膿毒癥合并急性胃腸損傷可進一步加重全身感染，加速SIRS向MODS的發生發展，并與患者不良預后密切相關［5-6］。最新研究證實，在導致膿毒癥胃腸損害的眾多機制中，炎癥介質的失控性釋放是其主要機制［7-8］，因此從炎癥反應入手探討減輕膿毒癥胃腸損傷具有重要意義。

近年來，中醫學在防治膿毒癥及器官損害方面進行了深入探索［9-10］。本研究團隊提出膿毒癥的根本病機為氣機逆亂，中焦脾胃是氣機逆亂的樞紐，調理中焦氣機是膿毒癥治療的關鍵。臨床研究發現，通過調理中焦氣機可明顯改善患者腹脹腹痛、惡心反流、便秘或下利等臨床癥狀，能降低患者腹內壓，恢復腸鳴音，減輕胃腸道損傷［11-12］。但其防治膿毒癥胃腸功能障礙方面的分子機制仍不明確。本研究擬從膿毒癥胃腸損傷著手，以炎癥反應為切入點，觀察調理中焦氣機法對膿毒癥大鼠腸屏障的保護作用，探討其分子機制，以期為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠，共40只，6～8周齡，SPF級，體質量（200±20）g，均購自山東彭悅實驗動物公司，合格證號SCXK（魯）20140007。飼養于恒溫（22±20）℃、恒濕（55±5）%條件實驗室。本實驗經山東中醫藥大學附屬醫院實驗動物倫理委員會批準（AWE-2019-047）。

1.2 實驗藥物

半夏瀉心湯組成：清半夏12 g，黃芩9 g，黃連3 g，人參9 g，干姜9 g，甘草9 g，大棗4枚（約16 g）。藥材購自山東中醫藥大學附屬醫院中藥房，制劑和質量控制由山東中醫藥大學附屬醫院制劑室負責。藥物配置方法：將顆粒煎煮、無菌濾膜過濾后，置60℃水浴箱內分別濃縮至含藥1.2、0.6、0.3 g/mL的藥液，常溫冷卻后，4℃冰箱保存備用。

1.3 試劑與儀器

白細胞介素-6（IL-6）試劑盒（Elabscience公司）；白細胞介素-1β（IL-1β）試劑盒（Elabscience公司）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（Elabscience公司）；兔kit（北京中杉金橋生物技術有限公司）；檸檬酸抗原修復液（福州邁新生物技術有限公司）；DAB顯色試劑盒（Solarbio公司）；IL-6抗體（武漢三鷹科技有限公司）；IL-1β抗體（武漢三鷹科技有限公司）；TNF-α抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；DAO試劑盒（Elabscience公司）；D-乳酸試劑盒（南京Sbjbio科技有限公司）；內毒素試劑盒（南京Sbjbio科技有限公司）。Muliskan酶標儀（美國Thermo Scientific公司）；37℃恒溫箱；可調微量移液槍（德國Thermor公司）；輪轉式切片機（LEICA公司）；病理組織漂烘儀（郝思琳儀器設備有限公司）顯微鏡（OLYMPUS公司）；隔水式恒溫培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海錦屏儀器有限公司）。

1.4 模型制備

采用盲腸結扎穿孔法（CLP）建立膿毒癥大鼠模型［13］。術前常規禁食8 h，術前腹腔麻醉，待麻醉完全后，中下腹部備皮，消毒后鋪無菌洞巾。雙人協作，沿腹中線先剪一長約1 cm切口，后逐層開腹，進入腹腔內，用無菌無齒鑷子輕輕探查找到盲腸。輕輕將盲腸從切口處牽拉至腹腔外，用4-0尼龍縫線結扎其近回盲瓣端1/3處（避免結扎回腸及盲腸系膜血管），在結扎處與盲腸盲端之間中點處用無菌注射器針頭從系膜緣向對系膜緣貫通穿刺，輕輕擠壓穿刺點附近盲腸并擠出少許腸內容物，將盲腸連同擠出的內容物一同還納入腹腔，逐層縫合并關閉腹腔，再次皮膚碘伏酒精消毒。另取8只大鼠進行相同的開腹探查術，不進行盲腸結扎和穿孔，作為假手術組。手術結束后予2 mL/100 g生理鹽水進行液體復蘇。

1.5 分組及給藥

40只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組和中藥高、中、低劑量組，每組8只。按照人-動物體表面積法來計算給藥劑量，假手術組、模型組予10 mL/kg生理鹽水灌胃；中藥低劑量組予半夏瀉心湯3.05 g/kg灌胃；中藥中劑量組予半夏瀉心湯6.1 g/kg灌胃；中藥高劑量組予半夏瀉心湯12.2 g/kg灌胃。每12小時給藥1次。

1.6 標本采集與檢測

1.6.1 血清二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸、內毒素水平檢測 給藥24 h后對大鼠進行充分麻醉，腹主動脈取血，分離血清，用ELISA法檢測血清DAO、D-乳酸、內毒素水平。

1.6.2 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腸道病理形態學變化 給藥24 h后取回腸部腸組織后經甲醛固定，乙醇脫水，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，HE染色，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察腸黏膜組織病理學改變，參照Chiu's腸黏膜損傷評分標準，根據炎癥、萎縮和腸上皮化生等組織學變化分為0～5級，分別計1～6分。

1.6.3 血清IL-1β、IL-6和TNF-α檢測 給藥24 h后對大鼠進行充分麻醉，腹主動脈取血，分離血清，用ELISA法檢測血清炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.6.4 免疫組化法檢測腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α表達 給藥24 h后取回腸部腸組織，制作石蠟切片，將石蠟切片進行脫蠟，3%H2O2去離子水中孵育，滴加試劑A，滴加一抗，滴加試劑B，滴加試劑C。使用蘇木素復染，再用鹽酸乙醇分化。透明后，樹脂膠封片，充分凝固后。在鏡下選擇染色均勻清晰區域進行圖像采集和分析，每腸組織選擇3張切片，在顯微鏡下每張切片分別截取5個視野，截取的這5個視野中每個視野互不重疊。

1.7 統計學處理

應用IBM SPSS20.0統計軟件。計量資料以（）表示，多組比較選用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。數據圖表選用Graphpad prism 6.0進行繪制。

2 結果

2.1 各組大鼠血清DAO、D-乳酸、內毒素水平比較

見表1。與假手術組相比，造模后大鼠血清DAO、D-乳酸和內毒素水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥治療組大鼠血清DAO、D-乳酸和內毒素水平均有降低（P＜0.01）；不同劑量組間比較，高劑量組治療效果最優（P＜0.01或P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清DAO、D-乳酸和內毒素水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組大鼠血清DAO、D-乳酸和內毒素水平比較（pg/mL，±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與中藥中劑量組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01。下同。

組別假手術組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 8 8 8 8 8 DAO 74.97±13.83 268.12±11.28*212.81±20.58*#▲169.79±4.53*#144.31±7.65*#▲D-乳酸772.85±19.09 1 330.38±33.86*1 140.31±19.94*#▲1 032.81±30.68*#883.93±23.90*#▲內毒素67.15±2.49 128.81±10.48*114.61±3.02*#▲94.51±3.65*#84.82±1.45*#△

2.2 各組大鼠腸道病理形態學變化

假手術組黏膜層腸上皮結構完整，上皮細胞形態結構正常、排列緊密，固有層腸腺豐富，可見較多杯狀細胞，未見明顯炎癥。模型組黏膜層可見大面積上皮細胞脫落，固有層裸露；局部可見潰瘍，固有層腸腺數量減少，被增生的結締組織取代，伴有較多淋巴細胞浸潤；局部可見靜脈血管淤血擴張。中藥治療組中中藥高劑量組腸黏膜損傷最輕，黏膜層局部可見少量上皮細胞脫落；固有層腸腺豐富，可見較多杯狀細胞，局部可見少量炎性浸潤。見表2，圖1。

表2 各組腸組織病理損傷Chiu's評分比較（分，±s）

表2 各組腸組織病理損傷Chiu's評分比較（分，±s）

組 別n 病理評分8 8 8 8 8假手術組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組1.00±0.76 5.25±0.46*4.37±0.52*#△3.75±0.46*#3.25±0.46*#△

圖1 各組大鼠腸道病理形態學變化（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較

見表3。與假手術組比較，各造模組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥治療組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平下降（P＜0.01），中藥高劑量組水平最低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

組別假手術組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 8 8 8 8 8 IL-1β 261.04±13.89 958.80±18.14*730.66±9.99*#▲554.19±57.47*#458.76±53.78*#▲IL-6 62.92±0.69 203.74±8.92*178.18±6.60*#▲126.86±12.09*#102.78±5.27*#▲TNF-α 24.97±2.82 116.10±11.95*82.19±10.08*#▲75.88±2.61*#51.72±0.99*#▲

2.4 各組大鼠腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α表達比較

見表4，圖2。使用ImageJ pro6.0軟件對免疫組化照片進行分析，每張切片選取3張200倍照片，計算其平均光密度進行比較分析。結果顯示，與假手術組相比，其余各組腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α陽性表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，中藥治療組大鼠腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α陽性表達顯著降低（P＜0.01）；中藥高劑量組陽性表達最低（P＜0.05）。

表4 各組大鼠腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較（±s）

表4 各組大鼠腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較（±s）

組別假手術組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 8 8 8 8 8 IL-1β 9.08±0.68 58.83±6.30*#45.46±4.37*#▲33.48±4.7*#23.44±3.47*#△IL-6 24.04±2.18 89.83±8.92*#69.39±7.10*#▲52.87±3.84*#39.79±2.79*#△TNF-α 1.47±0.25 12.11±1.87*#9.05±7.34*#▲6.29±0.96*#4.28±0.40*#△

圖2 各組大鼠腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α陽性表達

3 討論

膿毒癥是因感染導致的危及生命的器官功能障礙，胃腸道是膿毒癥時最易受損的器官，易發生胃腸功能障礙。胃腸功能的正常，有賴于腸道屏障功能的完整性。現代研究發現膿毒癥時炎癥因子過度釋放，失控的炎癥反應是導致腸道屏障功能損傷的主要病理機制。膿毒癥初期細菌內毒素或脂多糖與結合蛋白結合形成免疫復合物，與單核細胞或巨噬細胞表面的Toll樣受體相結合，加速炎癥因子的分泌與釋放，導致全身性炎癥表現。炎癥因子的大量釋放可對腸道上皮細胞造成損傷，引起腸黏膜水腫、充血，上皮細胞膜及細胞間固有連接斷裂，細胞壞死，造成腸道通透性增加、腸道屏障功能受損［14-15］。本研究采用國際公認的盲腸結扎穿孔法制備膿毒癥大鼠模型，研究發現，造模后膿毒癥大鼠血清DAO、D-乳酸、內毒素等反映腸道屏障損傷的指標明顯上升，提示膿毒癥大鼠腸道屏障受損，同時血清及腸組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯升高，提示發生了失控的炎癥反應，這與相關研究報道一致。

膿毒癥是一種復雜疾病，涉及全身多臟器，往往毒邪、痰濁、瘀血等諸邪畢至，相兼為病，單從某一臟某一腑進行論治，往往不能涵蓋整個膿毒癥病機。孔立教授認為縱觀膿毒癥整個病變過程，氣機逆亂貫穿于膿毒癥始終，西醫所說的器官功能障礙或衰竭，即是中醫的臟腑氣機逆亂，提出膿毒癥的根本病機為氣機逆亂，特點是始于一處、五臟皆亂。臟腑功能的正常要靠臟腑之氣的升降出入協調平衡，臟腑氣機逆亂，則精氣血精液化生和輸布異常，痰濁、瘀血、火毒之邪驟生，合而致病，日久由氣及血致虛，最終致氣血衰敗，出現臟腑受損，危及生命。孔立教授通過分析五臟生理特點并結合三焦辨證，進一步指出：五臟氣機逆亂始于肺，中焦脾胃是五臟氣機逆亂的樞紐，調理中焦氣機是膿毒癥治療的關鍵，應貫穿膿毒癥始終。

半夏瀉心湯源于漢·張仲景所著《傷寒雜病論》，仲景初用之治療痞證，后隨著中醫體系發展，其可用以治療各種因中焦氣機逆亂所致疾病，為調理中焦氣機代表方，方中半夏、干姜之辛散合黃芩、黃連之苦降，協調恢復中焦氣機升降之職。苦辛合用，寓開于瀉，通而有降，使清陽得升，濁陰得降，中焦氣機升降復常。同時，半夏瀉心湯寒溫并投、調和陰陽，甘溫調補、扶正祛邪的特點，正符合臨床對于膿毒癥胃腸功能障礙患者的治療要求。半夏瀉心湯藥理研究進展迅速，已證實其具有調控腸道炎癥反應、保護胃腸黏膜、改善腸道菌群、調節胃腸動力、免疫應答和調控胃腸激素分泌的作用［16-18］。本研究發現，給予半夏瀉心湯治療后，膿毒癥大鼠血清DAO、D-乳酸、內毒素水平明顯下降，腸道組織病理學評分降低，提示膿毒癥大鼠腸道屏障損傷減輕，同時血清及腸組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平也明顯下降，提示半夏瀉心湯治療能下調膿毒癥時失控的炎癥反應。同時，不同劑量組間比較，半夏瀉心湯高劑量組治療作用最優，具有劑量依賴性。

本研究通過盲腸結扎穿孔法制備膿毒癥大鼠模型，予調理中焦氣機的半夏瀉心湯干預，半夏瀉心湯治療能降低膿毒癥大鼠血清和腸組織中IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子水平，對膿毒癥大鼠腸屏障損傷具有保護作用，并存在劑量依賴性。本研究說明調理中焦氣機法可以減輕膿毒癥大鼠腸道屏障損傷，這可能與其抑制炎癥因子的釋放有關。