SARS-CoV-2輔助蛋白ORF8的功能及研究進展

付亞男，曾鳳，饒晶晶，黃艷萍，劉志新，劉龍

截至2022年5月25日，新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）共造成5億多人患病，600多萬人死亡［1］。SARSCoV-2與SARS-CoV同屬β冠狀病毒屬，基因組序列相似，均編碼刺突蛋白（spike protein，S）、核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）、膜蛋白（membrane protein，M）、包膜蛋白（envelope protein，E）、16種非結構蛋白及多種輔助蛋白。SARS-CoV-2與SARSCoV具有較高的序列同源性和蛋白質-蛋白質相互作用相似性［2］，但SARS-CoV-2和SARS-CoV的輔助蛋白ORF8具有較低的蛋白質序列同源性：核苷酸同源性為55.4%，蛋白質同源性為30%［3］。SARSCoV-2輔助蛋白在病毒生命周期和毒力強弱中發揮著重要作用，輔助蛋白ORF8與病毒復制無關，但能夠與宿主分子直接相互作用，提高了病毒感染的可能性［2］。目前，SARS-CoV-2輔助蛋白正快速進化及突變，可能會造成病毒毒力及傳播性的增加，而通過研究病毒輔助蛋白可為臨床診斷新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）提供新的途徑及治療藥物。本文主要歸納總結了SARS-CoV-2輔助蛋白ORF8的突變及功能，旨在為臨床治療COVID-19提供相關線索及理論支持。

1 SARS-CoV-2輔助蛋白ORF8的結構與功能

1.1 ORF8的結構SARS-CoV-2輔助蛋白ORF8的晶體結構為共價二聚體，ORF8單體結構是由β1～β8形成反向平行的β折疊；ORF8二級結構由1個短的α-螺旋、7個β-鏈和1個未知的外部結構域組成［4］。SARS-CoV-2 ORF8屬于免疫球蛋白（Ig）新家族，由N端序列和Ig樣折疊組成，是含有121個氨基酸的分泌蛋白，定位并富集于內質網（endoplasmic reticulum，ER）［5］。經多重比對和結構分析表明，SARS-CoV-2 ORF8與SARS-CoV ORF8蛋白是不同的新型病毒蛋白，兩者具有較低的序列相似性與結構同源性［6-7］。

1.2 ORF8的功能SARS-CoV-2通過結合血管緊張素轉換酶2（ACE2）受體進入細胞后，基因組序列編碼的開放閱讀框翻譯為不同的病毒蛋白，其中輔助蛋白在抵御宿主免疫反應過程中發揮了重要作用。機體在抵抗SARS-CoV-2感染的過程中涉及多條抗病毒信號通路，其中以Ⅰ型干擾素（typeⅠinterferon，IFN-Ⅰ）通路與核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路為主。IFN-Ⅰ和NF-κB通路主要通過誘導IFN-Ⅰ及炎性細胞因子的釋放來抵抗病毒感染。SARS-CoV-2 ORF8介導IFN-Ⅰ通路的抑制及NF-κB通路的激活，在抑制宿主免疫反應中起重要作用。（1）SARS-CoV-2 ORF8能夠抑制IFN-Ⅰ通路。①ORF8可以通過抑制干擾素刺激反應元件（interferon stimulus response element，ISRE）的產生與減少干擾素調節因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）的核轉位來抑制干擾素的產生［8-9］。②ORF8下調聚肌苷酸胞苷酸（polynosinlc acidpolycyttdylic acld，Poly I:C）誘導的IFN-β和干擾素刺激基因（interferon-stimulating genes，ISGs）表達［10］。③ORF8蛋白通過激活轉錄激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）和肌醇依賴酶1（inositolrequiring enzyme 1，IRE1）通路誘導內質網應激（ERS），ERS通路的激活在介導IFN-β產生方面具有重要的免疫調節作用［10］。然而，ERS通路的激活如何影響IFN-β和ISGs表達的詳細機制仍有待闡 明。（2）SARS-CoV-2感 染細胞 后，輔 助 蛋白ORF8在內質網直接與主要組織相容性復合體Ⅰ（major histocompatibility complexⅠ，MHCⅠ）分子相結合，促進MHCⅠ運輸到自噬體，隨后ORF8與自噬基因Beclin1相互作用，啟動自噬溶酶體降解，MHCⅠ的降解減少了其與CD8+T細胞的結合，介導SARS-CoV-2逃避CD8+T細胞的殺傷作用［11］。（3）SARS-CoV-2 ORF8通過與宿主重組白細胞介素17受體A（interleukin 17 receptor A，IL-17RA）相互作用激活白細胞介素17（interleukin 17，IL-17）信號通路來促進促炎因子表達，然后ORF8與IL-17RA結合募集NF-κB激活劑1（Act1），Act1可以與腫瘤壞死因子受體相關蛋白6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）結合激活NF-κB通路，導致大量炎性因子釋放［12］。同時IL-17抗體能夠通過抑制ORF8與IL-17RA的相互作用來控制細胞因子風暴，為治療COVID-19提供潛在靶點［13］。SARS-CoV-2在早期感染階段逃避宿主抗病毒免疫反應的機制見圖1。

1.3 SARS-CoV-2與SARS-CoV ORF8的 功 能 比較SARS-CoV ORF8是一種ER駐留膜蛋白［14］。在SARS-CoV流行的中晚期，ORF8蛋白伴隨著29個核苷酸（nucleotides，nt）缺失，導致ORF8a和ORF8b兩種截短功能蛋白的產生，SARS-CoV ORF8的29 nt缺失減弱了病毒的復制［15］。ORF8a和ORF8b分別編碼39個和84個殘基多肽，ORF8a的氨基酸個數太少，因此不能發揮信號功能；ORF8b蛋白極其不穩定，會迅速降解［16］。ORF8ab通過誘導ATF6蛋白水解和加工的N端的核易位來調節未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）［14］。ORF8ab的N81是其N-連接糖基化位點，糖基化對蛋白質的寡聚化、分選、運輸和折疊起重要作用［17］。未糖基化的ORF8ab是不穩定的，這解釋了在沒有ORF8a區域的情況下，ORF8b會迅速降解，并推測糖基化有助于ORF8b的折疊［18］。SARS-CoV輔助蛋白ORF8b和ORF8ab以泛素-蛋白酶體依賴性方式誘導IRF3的降解，從而導致IRF3二聚化減少，最終抑制IFN-β信號通路［19］。ORF8b區域可能包含多個功能域來發揮功能，如泛素結合、泛素化和糖基化等，從而參與ORF8ab穩定性、宿主-病毒相互作用和生化特性的調節［18］。然而，迄今為止尚未在ORF8a區域中鑒定出功能域，但ORF8a可以通過線粒體依賴性途徑誘導細胞凋亡［20］。這表明沉默蛋白ORF8ab的表達可能是靶向SARS-CoV逃避宿主防御機制的策略［14］。

Fig.1 Diagram of the mechanism of SARS-CoV-2 ORF8 escaping host antiviral immune response圖1 SARS-CoV-2 ORF8逃避宿主抗病毒免疫反應機制圖

2 SARS-CoV-2輔助蛋白ORF8的突變

2.1 ORF8截短突變SARS-CoV-2輔助蛋白ORF8具有快速進化的特性，且正在經歷快速的非隨機進化［21］。2020年1月23日—3月25日，新加坡和中國臺灣收集的191個臨床樣本中有23.6%存在ORF8 382 nt的缺失，表明該缺失突變體保留了在人與人之間有效感染及傳播的能力［7］。該突變體導致了ORF8/ORF7b的缺失，其與較輕的癥狀和較低的病毒復制能力有關［22］。SARS-CoV-2 ORF8缺失突變體會影響蛋白質的轉錄調控，如5′端336 nt缺失消除了ORF8轉錄調控序列［23］。2020年12月發現的ORF8 Q27stop突變體可能改變了病毒的傳播能力，基因組中大多數刺突蛋白的突變與ORF8 Q27stop和ORF8 K68stop相關，表明監測ORF8的缺陷譜系對了解COVID-19的流行至關重要［24］。目前，SARS-CoV-2輔助蛋白ORF8缺失突變體仍在繼續進化，且將有可能進化為另一進化枝，這一發現將有助于了解SARS-CoV-2的傳播及進化動態。

2.2 ORF8點 突 變SARS-CoV-2 ORF8第84位 氨基酸為亮氨酸或絲氨酸，因此具有ORF8L和ORF8S兩種核苷酸序列［25］。研究者從6 337個核苷酸序列中鑒定出240個SARS-CoV-2 ORF8的非同義突變，其中7%是無義突變，93%是錯義突變，在這些突變體中，L84S為最主要的突變［26］。L84S突變通常會伴隨V62L突變，V62L和S24L突變可能具有臨床意義［27］。SARS-CoV-2 ORF8突變體導致該病毒在傳染性、致病性和免疫逃逸方面存在顯著差異，其原因可能是病毒突變體增強了病毒逃避宿主免疫系統的能力，ORF8 L84S突變體不能像野生型抗原肽一樣與MHCⅡ等位基因抗原結合槽結合，從而產生逃避宿主細胞免疫反應的能力［28］。特別是W45L突變體，能夠增加其與IRF3的結合親和力來幫助病毒逃避免疫系統［9］，表明ORF8突變體可能會進一步逃避宿主免疫監視。S24L是ORF8中第二大常見的突變，其可以增加ORF8蛋白的折疊穩定性，并與SARS-CoV-2的傳播有關［29-30］。因此，SARS-CoV-2ORF8突變體的出現可能與病毒免疫逃逸和毒力增強有關。

3 SARS-CoV-2輔助蛋白ORF8在COVID-19診斷和治療中的前景

3.1 ORF8抗體在血清學檢測和診斷中的應用前景SARS-CoV-2以高毒力、高傳染性為特征，常用的檢測方法多為血清學檢測［31］。SARS-CoV-2ORF8具有分泌性而被表征為新型免疫原性分泌蛋白，在COVID-19患者的血清中能夠檢測到ORF8抗體。研究發現ORF8抗體的產生早于N蛋白抗體，抗ORF8抗體的檢測比傳統的抗N抗體檢測更靈敏和準確，通過ELISA分析表明，ORF8在COVID-19患者的抗體反應方面具有高度免疫原性［6］。據此，SARS-CoV-2 ORF8抗體可以用來進行血清學檢測和診斷，同時也為疫苗開發提供了依據。

3.2 ORF8在藥物治療中的應用前景SARS-CoV-2 ORF8作為拮抗宿主天然免疫反應的重要蛋白，通過抑制ORF8來改善病毒的免疫逃逸和病毒感染可能是一種有效的治療策略。通過鑒定高可信度的SARS-CoV-2蛋白質-宿主蛋白質相互作用網絡，研究人員確定了69種相互作用物，其中66種可以用于藥物研究，并發現47種人類蛋白質與SARS-CoV-2輔助蛋白ORF8相互作用；其中有15種是處于臨床前、臨床試驗或已獲得美國食品和藥物管理局（FDA）批準的已知藥物靶點［32］。從灌木葉中分離出的化合物具有作為免疫調節劑的潛力，這些化合物能夠與SARS-CoV-2 ORF8 mRNA的翻譯起始位點及翻譯終止位點結合，從而抑制與COVID-19感染有關的細胞因子風暴，因此建議進一步研究灌木葉分離出的化合物的免疫調節特性及ORF8蛋白在COVID-19感染藥物開發中的作用［33］。另外，ORF8可以激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（P13K/Akt/mTOR）信號通路以維持病毒增殖的環境；雷帕霉素是雷帕霉素靶蛋白復合物1（mTORC1）的抑制劑［3］，通過雷帕霉素抑制mTORC1的活性來阻斷細胞生長途徑可能是抵抗病毒感染的治療策略。

4 小結與展望

SARS-CoV-2 ORF8不 僅 對COVID-19的 發 病機制和免疫調節具有重要作用，而且對于藥物和診斷試劑的開發也很重要。SARS-CoV-2 ORF8抗體較N抗體具有較高的靈敏度和準確性而被提議用作血清學檢測和診斷COVID-19的標志物［6］。但ORF8較高的突變性和進化性可能會影響血清學反應和作為治療靶點的可行性［3］。目前已經有研究報道，ORF8中的突變體能夠增加其與IRF3的結合親和力，從而幫助病毒逃避宿主免疫系統［9］。因此這種高突變性及高進化性很有可能會加重病毒對人體的感染及在宿主體內的復制。目前尚不清楚ORF8變異是否會影響抗原表位的變化，因此必須研究SARS-CoV-2 ORF8的各種自然變異對檢測及診斷COVID-19的潛在影響。

同時，SARS-CoV-2 ORF8蛋白通過影響宿主各種免疫途徑來逃避免疫監視，研究其背后的分子機制將增進對ORF8在COVID-19發病機制中作用的認識，有助于開發有效的抗病毒藥物。今后需要進一步揭示SARS-CoV-2 ORF8高頻突變的重要性及其對宿主免疫應答相關的影響，這將有利于SARSCoV-2的溯源工作。